乳制品中糠氨酸檢測(cè)方法改進(jìn)

□ 黃文強(qiáng) 內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 蘇玉芳 內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司

張彩霞 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司

糠氨酸是美拉德反映的初期產(chǎn)物之一，高溫有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生，長(zhǎng)時(shí)間低溫也能發(fā)生反應(yīng)[1]。乳制品中參與反應(yīng)的主要是賴氨酸與乳糖，賴氨酸是人體合成各種蛋白質(zhì)所需的重要物質(zhì)，缺少賴氨酸，其他氨基酸會(huì)受到限制或得不到利用，影響人體對(duì)乳制品營(yíng)養(yǎng)的吸收[2]。通過測(cè)定糠氨酸的含量可以評(píng)價(jià)美拉德反應(yīng)的程度，而美拉德反應(yīng)的程度與牛奶產(chǎn)品加工過程中的加熱類型和強(qiáng)度直接相關(guān)聯(lián)，反映了成品液態(tài)奶工藝與品質(zhì)的優(yōu)劣[3-4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部早在2005年發(fā)布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)將巴氏奶、超高溫滅菌乳中的糠氨酸含量作為鑒定是否為復(fù)原乳的因子之一[5]，同時(shí)對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)，原奶的糠氨酸含量可作為原奶是否摻入復(fù)原乳（奶粉）的判定因素，因此生產(chǎn)企業(yè)建立穩(wěn)定、高效的乳制品糠氨酸的測(cè)定方法具有十分重要的意義。本文對(duì)2016年發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》（NY/T 939-2016）的糠氨酸檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，可持續(xù)、大量的檢測(cè)樣品，可檢測(cè)1 000份樣品以上且色譜柱性不會(huì)受到影響，同時(shí)方法精密度（變異系數(shù)）小于1%，回收率為90.6%～93.8%。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸，甲醇（色譜純），三氟乙酸（色譜純）。

1.2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：

用3.0 moL/L鹽酸溶液將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（品牌Iris）配成150～ 200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%三氟乙酸溶液或者水配制成濃度梯度約為0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、 2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 儀器設(shè)備

四元梯度液相色譜儀配有紫外或DAD檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司），C18SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司），凱氏定氮儀，烘箱（110℃±2℃），帶密封螺紋蓋20 mL耐熱玻璃試管，萬分之一天平。

1.4 檢測(cè)操作

1.4.1 樣品水解液的制備

取2 mL待測(cè)樣品置于帶密閉蓋的耐熱玻璃試管中，加入6 mL的 10.6 moL/L的鹽酸溶液混勻，密閉試管，然后將其置于110 ℃干燥箱中加熱水解過夜（12 h以上），加熱約1 h后，取出晾涼后搖勻一次，次日加熱結(jié)束后，取出冷卻后濾紙干 過濾。

1.4.2 樣品水解液中糠氨酸測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1 mL的樣品水解液到試管中，準(zhǔn)確加入5 mL 0.1%三氟乙酸溶液，混勻，0.45 μm濾頭過濾。

1.4.3 樣品水解液中蛋白質(zhì)測(cè)定

依照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2016）計(jì)算水解液蛋白質(zhì)含量m。

1.5 糠氨酸的液相色譜儀測(cè)定

1.5.1 糠氨酸檢測(cè)的色譜參考條件

柱溫箱32 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm，進(jìn)樣體積10 μL，流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.08%～0.10%三氟乙酸溶液（依據(jù)實(shí)際分離效果確定），流速1.0 mL/min。泵梯度洗脫程序：0～7 min，流動(dòng)相A由0%升 至10%，流動(dòng)相B由100%降至90%；7～10 min，流動(dòng)相A由10%升至30%，流動(dòng)相B由90%降至70%；10～20 min，流動(dòng)相A由30%升至90%，流動(dòng)相B由70%降至10%；20～25 min，流動(dòng)相A由90%降至10%，流動(dòng)相B由10%升至90%；25～32 min，流動(dòng)相A由10%降至0%，流動(dòng)相B由90%升至100%；

1.5.2 測(cè)定

采用10%流動(dòng)相A與90%流動(dòng)相B進(jìn)行基線平衡，再開始樣品測(cè)定。

1.6 樣品糠氨酸含量計(jì)算公式

式中：W-樣品中糠氨酸含量，mg/100 g蛋白質(zhì)；C-樣品水解液糠氨酸濃度，μg/mL；D-水解液糠氨酸稀釋倍數(shù)或定容體積；m-樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=32.561x-0.1338，線性相關(guān)性0.999。

2.2 回收率

以生牛乳作為加標(biāo)本底進(jìn)行3個(gè)濃度梯度的加標(biāo)回收，回收率結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在100～200 mg/100 g 蛋白質(zhì)的濃度下，不同加標(biāo)濃度的回收率為90.6%～93.8%。

表1 糠氨酸不同加標(biāo)濃度的回收率結(jié)果

2.3 精密度

隨機(jī)對(duì)一滅菌乳樣品進(jìn)行了7次糠氨酸檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果分別為 134.4 mg/100 g蛋白質(zhì)、136.9 mg/100 g 蛋白質(zhì)、135.2 mg/100 g蛋 白 質(zhì)、134.3 mg/100 g蛋白質(zhì)、136.8 mg/100 g蛋白質(zhì)和135.0 mg/100 g蛋白質(zhì)，方法精密度RSD為0.73%。

3 結(jié)論

相比行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的液相色譜法，該方法采用流動(dòng)相或水配制工作液，未采用腐蝕性的鹽酸，避免高濃度鹽酸對(duì)進(jìn)樣器和色譜柱的損傷，保護(hù)了儀器設(shè)備。本方法選擇了更耐受純水溶液及低酸度流動(dòng)相的反相色譜柱，保證檢測(cè)效果，延長(zhǎng)了色譜柱使用壽命，經(jīng)實(shí)際實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，至少可測(cè)試 1 000個(gè)樣品以上，相對(duì)于普通的C18反相柱僅可檢測(cè)300個(gè)左右的樣品有了大幅度改進(jìn)。