柱前在線衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸

□ 張冬生 李 強(qiáng) 翟洪穩(wěn) 王 娟 河北省食品安全重點實驗室 河北省食品檢驗研究院

?；撬崾且环N含硫氨基酸，主要以游離狀態(tài)存在于動物乳汁、腦與心臟中，在哺乳動物的心臟中含量最高。?；撬岢四艽龠M(jìn)大腦的正常發(fā)育外，還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[1]。

常用的?；撬岷繙y定方法有酸堿滴定法、熒光法、氨基酸分析儀法、薄層掃描法和高效液相色譜法等[2-8]。牛磺酸屬于極性大且無紫外吸收的化合物，需進(jìn)行衍生化。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y定方法為鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色譜法[9]。樣品經(jīng)預(yù)處理，在鈉離子氨基酸分析專用柱中被分離，再與OPA進(jìn)行衍生反應(yīng)，由熒光檢測器進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。該方法具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，但是分離需使用專用的鈉離子氨基酸交換柱和柱后衍生反應(yīng)器、衍生劑驅(qū)動泵等專用輔助儀器。本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法不同，采用柱前在線加入OPA衍生化試劑，在堿性條件下與?；撬岙a(chǎn)生強(qiáng)熒光的物質(zhì)，通過熒光檢測器測定衍生物的含量，以此來確定?；撬岬暮?，其操作簡單方便、檢測快速、靈敏，且不需輔助儀器，只需通過普通的液相色譜C18柱就可進(jìn)行?；撬岬臏y定。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（配有熒光檢測器），安捷倫公司；KQ-250DV超聲儀，昆山市超聲有限公司；3K15離心機(jī)，SIGMA公司。

1.2 試劑與配制溶液

1.2.1 試劑

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%,購于Chem Service；乙腈、甲醇、三水合乙酸鈉、氫氧化鉀，均為色譜純，購自上海阿拉丁公司；三乙胺、四氫呋喃、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸、2-巰基乙醇（C2H6OS）均為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑公司；實驗用水為GB/T 6682- 2008規(guī)定的一級水；聚氧乙烯月桂酸醚（Brij-35），高級純,購自麥克林公司。

1.2.2 溶液配制

硼酸鉀溶液（0.5 mol/L）：稱取30.9 g硼酸，26.3 g氫氧化鉀，用水溶解并定容至1 000 mL。

鄰苯二甲醛衍生溶液：稱取0.60 g 鄰苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解后，加入0.5 mL2-巰基乙醇和0.35 g Brij-35，用0.5 mol/L硼酸鉀溶液定容至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾[10]?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.0 mg/mL的?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100.0 mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。將?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲備液用水稀釋制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為：0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL。

1.3 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.01 mol/L NaAc+0.018%三乙胺+0.3%四氫呋喃，B相 為0.01 mol/L的NaAc水溶液+40%乙腈+40%甲醇。流速： 1.0 mL/min；柱溫：室溫；熒光檢測器設(shè)置：0～19 min，運(yùn)行時間：1 min，梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4 樣品處理

稱取5 g奶粉試樣（精確至0.01 g），加入40 ℃左右的溫水溶解，充分搖勻，加入80 μL冰乙酸，搖勻后移入 100 mL容量瓶中；于超聲波振蕩器中超聲10 min，用水定容至100 mL； 樣液離心，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾。

1.5 測定

采用自動進(jìn)樣器進(jìn)行OPA柱前衍生：吸取硼酸緩沖液5.0 μL，然后吸取1.0 μL OPA試劑混合，用水洗針，吸取被測樣品0.5 μL，用水洗針，混合6次后依據(jù)上述色譜條件進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 衍生試劑的用量

?；撬嵝枧c衍生試劑反應(yīng)后利用熒光檢測器進(jìn)行分析，因此衍生試劑的選擇及用量非常重要，其直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實驗對衍生試劑的用量進(jìn)行研究，取3份0.5 μL牛磺酸（1 000 μg/L）標(biāo)樣，分別加入 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL衍生試劑后進(jìn)行分析。實驗結(jié)果表明，在樣品與衍生試劑比例為1∶2時，測得色譜峰面積達(dá)到最大，且重復(fù)性良好，隨著衍生試劑用量的增加，測得的色譜峰面積沒有明顯變化，因此選擇樣品與衍生劑均為1∶2。

2.1.2 衍生化時間的選擇

衍生時間也對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，需考察不同衍生時間對?；撬嵫苌锓迕娣e的影響。OPA與硫醇試劑連用，在室溫堿性條件下與一級氨基酸的衍生化反應(yīng)僅需30 s即可完成[10]。在其他條件不改變的情況下，本實驗對比了3種衍生時間，振蕩后直接進(jìn)樣、混合振蕩后等待1 min和2 min進(jìn)樣，對比3種反應(yīng)時間，發(fā)現(xiàn)峰面積沒有區(qū)別，為節(jié)約檢測時間，選擇混合振蕩后直接進(jìn)樣。

2.1.3 檢測波長的選擇

用5 μg/mL?；撬?標(biāo)準(zhǔn)溶液 按上述柱前在線衍生化反應(yīng)，用熒光檢測器掃描發(fā)射波長和激發(fā)波長。發(fā)射波長的選擇：固定激發(fā)波長，在375～550 nm范圍內(nèi)改變發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長的選擇：把發(fā)射波長設(shè)置為優(yōu)化好的數(shù)值，在260～400 nm范圍內(nèi)改變激發(fā)波長測定熒光強(qiáng)度[11]。按照上述方法設(shè)置發(fā)射和激發(fā)波長，根據(jù)測定峰值確定?；撬岬臋z測波長為EX330 nm，EM530 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)軸，吸收峰面積為縱坐標(biāo)軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，由最小二乘法計算?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=47.261x+24.42，相關(guān)系數(shù)r=0.996。色譜峰面積與?；撬岷砍柿己镁€性關(guān)系，可用于奶粉中?；撬岷康亩繖z測。

表2 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

2.2 精密度實驗

精確吸取同一試樣溶液（25 μg/mL），按上述方法，進(jìn)行6次平行測定，計算?；撬岱迕娣e的RSD=1.67%（n=6），結(jié)果如表3。

表3 精密度實驗

2.3 重復(fù)性實驗

取同一批樣品6份，準(zhǔn)確稱量，按本方法處理，進(jìn)行色譜條件測定，樣品中?；撬岷繛?0.93 mg/100 g（n=6），RSD為1.28%（n=6）。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 重復(fù)性實驗

2.4 加標(biāo)回收率實驗

在嬰幼兒配方奶粉樣品中加入已知含量的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法的試驗步驟進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。從表中可以看出，加標(biāo)回收率在96.8%～103.6%，RSD=2.9%（N=6）。

表5 ?；撬峄厥章蕦嶒灲Y(jié)果

2.5 線性范圍確定

根據(jù)儀器信噪比，配制不同濃度的?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測定，然后根據(jù)濃度和峰面積繪制工作曲線。經(jīng)過多次試驗，結(jié)果表明當(dāng)?；撬岬臐舛仍?.05～100 μg/mL的范圍內(nèi)時，工作曲線仍然具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均能達(dá)到0.996。因此可以確定?；撬峋€性范圍為0.05～ 100 μg/mL。

3 結(jié)論

本方法使用自動進(jìn)樣器進(jìn)行程序設(shè)定，利用鄰苯二甲醛作為柱前衍生劑，完成樣品在線柱前衍生，奶粉樣品只需要經(jīng)過水的溶解、冰乙酸沉淀蛋白、過濾處理后即可上機(jī)檢測，與離線柱前衍生方法相比，減少了煩瑣的手工操作和誤差，與柱 后衍生方法相比，無需配備專用的柱后衍生儀器，前處理方法簡單，操作方便，節(jié)約了分析成本，易于推廣。該方法還具有較寬的線性范圍、較高的回收率和良好的穩(wěn)定性，能達(dá)到嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸的檢測 要求。