連作百香果對土壤理化性質和微生物特性的影響及病原真菌的分離與鑒定

陳曉婷 王裕華 林立文 張清旭 汪鵬 丁力 郭萬財 王海斌

摘 ?要：為了分析連作對百香果土壤理化性質及微生物的影響，本研究以種植0（未種植）、1、2、3 a的百香果根際土壤為材料，分析連作百香果對土壤理化指標、自毒潛力、微生物數量的影響，并對連作百香果根際土壤病原真菌進行分離、鑒定。結果表明，隨著種植年限的增加，百香果根際土壤pH呈顯著下降趨勢，土壤總氮、磷、鉀含量變化較小，而有效性氮、磷、鉀含量及有機質含量呈上升趨勢。自毒潛力分析結果表明，與對照（0 a，未種植）相比，種植1、2、3?a的百香果根際土壤對受體萵苣的抑制率分別為39.84%、54.36%、61.83%。微生物數量分析結果表明，隨著百香果種植年限的增加，土壤細菌與放線菌數量呈顯著下降趨勢，而真菌數量呈顯著上升趨勢。相關性分析結果表明，百香果種植土壤的年限與土壤pH、細菌、放線菌數量呈極顯著負相關，而與土壤有效氮、有效磷、有效鉀含量及真菌數量呈顯著或極顯著正相關。微生物分離與鑒定結果表明，共分離到9種不同類型的真菌，其中真菌BXG 3、BXG 7、BXG 9可顯著影響百香果的正常生長;鑒定結果表明，真菌BXG 3、BXG 7、BXG 9分別為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、棕黑腐質霉菌（Humicola?fuscoatra）和毛栓菌（Trametes hirsute）。

關鍵詞：百香果;連作;土壤微生物;真菌

Abstract： In order to analyze the effect of continuous cropping of passion fruit on the soil physicochemical property and microorganism， the rhizospheric soils cultivated for 0， 1， 2 and 3 years were used as the materials. Soil physical and chemical indicators， autotoxicity potential， and microbial quantity were analyzed. Furthermore， the pathogenic fungi in rhizosphere soil were isolated and identified. The results showed that the pH value of the passion fruit rhizosphere soil showed a significant downward trend with the passage of planting. Total nitrogen， phosphorus and potassium content changed little， while available nitrogen， phosphorus， potassium and organic matter content increased. The results of autotoxicity potential analysis showed that the inhibition rates of 1-， 2-， 3-year-old rhizosphere soil on lettuce was 39.84%， 54.36% and 61.83%， respectively， compared with the control （0 years）. The results of microbial quantitative analysis indicated that the number of soil bacteria and actinomycetes decreased significantly with the passage of planting， while the number of fungi increased significantly. Correlation analysis suggested that the planting years of the passion fruit soil was significantly negatively correlated with pH value， and the content of bacteria and actinomycetes， but significantly positively correlated with the content of available nitrogen， available phosphorus， available potassium and the number of fungi. The results of microbial isolation showed that nine different kinds of fungi were isolated， and the fungi of BXG 3， BXG 7 and BXG 9 could significantly affect the growth of passion fruit. The identification results showed that BXG 3， BXG 7 and BXG 9 fungi were Fusarium proliferatum， Humicola?fuscoatra and Trametes hirsute， respectively.

Keywords： passion fruit （Passiflora edulis Sims）; continuous cropping; soil microorganism; fungi

百香果，學名西番蓮（Passiflora edulis Sims），又名雞蛋果、熱情果等，具有菠蘿、香蕉、蘋果、檸檬等多種水果的復合芳香，是西番蓮屬草質藤本植物[1]。目前，我國種植的百香果主要有黃色百香果（P. flavicarpa）和紫色百香果（P. edulis）2種。百香果是多年生的藤本植物，第一次種植時年產量較高，然而從第二年開始，產量逐漸下降，病蟲害暴發(fā)頻率增多，這種現象產生后，主要以施肥和使用農藥為主進行改善，但效果并不明顯[2-3]。

土壤是植物種植的載體，微生物作為土壤微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，發(fā)揮著極其重要的作用，例如，在土壤物質轉化、分解，土壤肥力改變，土壤質地的改善等[4-5]。細菌、真菌、放線菌等微生物類群是土壤微生物群落結構的主要組成部分，其在土壤中的數量、種類及其結構的變化，直接或間接地影響著植物根際土壤的微生態(tài)功能[6-7]。土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物總量與活性和有益微生物數量的高低是判斷土壤活躍性的重要指標，而作物連作極易導致植物釋放物質的積累加劇，物質長期大量積累抑制了土壤有益微生物生長，滋生病原菌，使連作土壤中的微生物結構發(fā)生變化，總量減少[8-10]。此外，人為因素的干擾也加劇了土壤微生態(tài)環(huán)境的變化。例如，百香果的單一種植導致病蟲害的爆發(fā)并蔓延，因此種植戶為了有效控制百香果病蟲害，導致農藥的大量使用[11]。農藥的大量使用打破了原有的土壤微生態(tài)系統(tǒng)，致使土壤中益生菌數量減少，病原菌數量增多且產生了一定的抗藥性。例如，連作玉米導致根際土壤中的熒光假單胞菌數量增加，釋放的代謝產物氫氰酸含量加大，對玉米自身生長的毒害作用加劇[12]?？梢?，作物長期連作后，土壤微生物種群發(fā)生變化，土壤微生態(tài)系統(tǒng)的平衡失調，進而導致作物生長受阻。Wang等[13]前期研究發(fā)現，連作導致百香果的生理保護能力降低，光合作用能力降低，最終導致百香果的產量和品質下降。然而，這種現象的產生是否與土壤中的微生物，特別是病原微生物存在一定的聯(lián)系，尚未見相關文獻報道。

據此，本研究以種植1、2、3 a的百香果根際土壤及未種植（0 a）百香果的土壤為材料，分析連作百香果對土壤理化指標、自毒潛力，微生物數量的影響，并分離、鑒定連作百香果根際土壤病原真菌，以期為連作百香果土壤的修復和連作障礙的消減提供一定的研究基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以種植0、1、2、3 a的百香果根際土壤為材料，其中0?a土壤為同一區(qū)域未種植百香果的土壤。取樣點位于福建省龍巖市新羅區(qū)，海拔600～ 700?m，北緯250°，東經116°，年降雨量1700?mm，相對濕度80%，年平均氣溫16～20?℃。

收集種植1、2、3 a的百香果根際土壤，取樣方法：每個年份的百香果種植地隨機選擇12株百香果，移除土壤表面的樹葉，挖去周圍土壤，收集百香果根際土壤。每個年份百香果種植地，4株百香果為1個樣本，以同一區(qū)域未種植百香果的土壤為對照（0 a），收集3個重復樣本，每個樣本300 g。收集的土壤材料分為2部分，一部分鮮土用于土壤自毒潛力測定、土壤微生物數量測定及土壤真菌的分離;另一部分土壤自然風干后，粉碎并過60目篩，采用四分法取樣，用于土壤理化指標測定，土壤理化指標測定參照文獻[14]的方法。

1.2 ?方法

1.2.1 ?土壤自毒潛力測定 ?采用土壤瓊脂三明治法對不同種植年限的土壤樣本進行自毒潛力測試[10]。具體步驟：將冷卻至45?℃的30 mL瓊脂（0.8%）加入培養(yǎng)皿（直徑5 cm）中，取土壤樣品各15 g，混合固化后，在土壤-瓊脂層表面添加瓊脂（0.5%）2 mL，以減少水分流失。冷卻后，將10顆預萌發(fā)的萵苣種子置于瓊脂培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25?℃、光照12 h（7：00—19：00），培養(yǎng)3 d后測定萵苣的根長，設置6個重復。根長相對抑制率（IR）的計算公式：IR=（1-處理值/對照值）×100%。

1.2.2 ?土壤微生物數量測定 ?采用稀釋涂抹平板計數法[15]測定土壤中細菌、真菌、放線菌的數量。細菌采用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌采用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌采用淀粉硝酸鉀培養(yǎng)基培養(yǎng)，微生物數量以每克樣品的菌數表示（CFU/g）。

1.2.3 ?土壤微生物的qRT-PCR定量分析 ?土壤微生物總DNA的提取采用Bio 101 FastDNA SPIN Kit（Bio 101， Inc.， USA），土壤用量為0.5 g鮮土[16]。DNA檢測采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化采用膠回收試劑盒（TianGen Biotech Co.， Ltd），純化后的DNA置于-20?℃中保存，備用。

細菌定量分析所用的引物[17]為F27：5- AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3，R1492：5- TACHHYTACCTTGTTACGACTT-3，PCR反應體系25 μL，其中模板DNA、SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa Biotechnology）、F27引物、R1492引物、ddH2O等，分別為0.5、12.5、1、1、10?μL;PCR反應程序：94?℃預變性4 min;94?℃、1 min，55?℃、1 min，72?℃、1?min，收集熒光信號，30個循環(huán)。

真菌定量分析所用的引物[18]為5.8S：5- CGCTGCGTTCTTCATCG-3，ITSIF：5-CTT GG T CATTTAGAGGAAGTAA-3，PCR反應體系25?μL，其中模板DNA、SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa Biotechnology）、5.8S引物、ITSIF引物、ddH2O等，分別為1、12.5、1、1、9.5?μL;PCR反應程序：95?℃預變性5 s;94?℃、30 s，53?℃、30 s，72 ℃、30 s，收集熒光信號，40個循環(huán)。

放線菌定量分析所用的引物[19]為Act920F：5-TACGGCCGCAAGGCTA-3，Act1200R：5- TCRTCCCCACCTTCCTCCG-3，PCR反應體系25?μL，其中模板DNA、SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa Biotechnology）、Act920F引物、Act1200R引物、ddH2O等，分別為1、12.5、1、1、9.5?μL;PCR反應程序：95?℃預變性10 min;95?℃、15 s，65?℃、30 s，72?℃、15?s，收集熒光信號，40個循環(huán)。

1.2.4 ?土壤真菌分離 ?采用傳統(tǒng)的平板稀釋涂布法分離菌株，分離獲得的真菌菌株用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）做成的固體斜面在4?℃下保藏[20]。

1.2.5 ?真菌對百香果組培苗的侵染測定 ?將健康的百香果莖端（表面滅菌）移入經高溫高壓滅菌處理的培養(yǎng)基中心，每瓶1株，培養(yǎng)30?d后，挑選長勢一致的百香果組培苗進行接種試驗。無菌條件下，在離百香果組培苗莖端2?cm處接種一圈培養(yǎng)過夜的真菌菌液，15?d后，觀察百香果組培苗長勢，對照組以添加等量PDA培養(yǎng)基代替[21]。

1.2.6 ?真菌的鑒定 ?形態(tài)學鑒定。菌株的形態(tài)學鑒定以菌株的菌落及分生孢子形態(tài)為鑒定依據，將分離的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，28?℃培養(yǎng)3?d，觀察菌落形態(tài)，在顯微鏡下隨機測量50個分生孢子的大小并記錄其形態(tài)特征。

分子鑒定法。DNA提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司購買的真菌基因組提取試劑盒。真菌鑒定的特異性引物為NS1：5-GTAG TC ATATGCTTGTCTC-3，NS6：5-GCATC AC AGA CCTGTTATTGCCTC-3，對菌株的18S rDNA進行擴增。PCR程序為：預變性94 ℃、5?min，循環(huán)94 ℃、30 s，55 ℃、35 s，72?℃、1?min，35個循環(huán)，72 ℃，延伸8 min。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應結果[20]。DNA提取和測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，將測得序列到NCBI數據庫進行比對，獲取同源性最高的微生物。

1.3 ?數據處理

采用Excel軟件進行實驗數據的統(tǒng)計與初步分析，采用SPSS軟件進行數據的方差、顯著性分析和相關性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?百香果根際土壤的理化性質分析

不同種植年限百香果根際土壤的理化指標分析結果表明（表1），土壤pH隨著種植年限的增加，呈顯著下降趨勢。除總氮在第3年土壤有顯著下降外，土壤總磷、總鉀在不同種植年限間無顯著差異。土壤有效氮、有效磷、有效鉀及有機質含量呈上升趨勢，以種植3?a的土壤最高。其中，種植1、2、3?a間的土壤有效氮含量無顯著差異，但與對照間呈顯著性差異;種植0 a和1?a間、2 a和3 a間土壤有效磷無顯著差異，但種植0、1 a土壤與種植2、3?a年土壤之間呈顯著性差異;種植0、1、2?a間土壤有機質含量無顯著性差異，而與種植3?a的土壤呈顯著性差異。其次，不同種植年限間，土壤有效鉀含量均呈顯著性差異?？梢?，連作百香果根際土壤理化性質的變化，主要表現為土壤酸化趨勢明顯，有效性養(yǎng)分含量增加。

2.2 ?百香果根際土壤的自毒潛力分析

不同種植年限百香果根際土壤的自毒潛力分析結果表明（表2），隨著種植年限的增加，百香果根際土壤對受體萵苣根長的抑制率呈顯著上升趨勢。與對照相比（0 a），種植1、2、3 a的百香果根際土壤對受體的抑制率分別為39.84%、54.36%、61.83%?？梢?，連作百香果根際土壤存在一定的自毒作用。

2.3 ?百香果根際土壤微生物數量分析

稀釋涂抹平板計數法測定結果表明（圖1），隨著百香果種植年限的增加（0～3?a），土壤細菌與放線菌數量呈顯著下降趨勢，即細菌從16.18× 106?CFU/g下降到9.14×106?CFU/g，放線菌從11.65×106 CFU/g下降到6.24×106 CFU/g;而真菌數量則呈顯著上升趨勢，即從3.62×104 CFU/g上升到7.89×104 CFU/g。熒光定量PCR法測定結果表明（圖2），隨著百香果種植年限的增加（0～3?a），土壤細菌與放線菌數量依然呈顯著下降趨勢，真菌數量呈顯著上升趨勢?？梢?，隨著百香果連作年限的增加，百香果根際土壤微生物數量發(fā)生變化，表現為細菌、放線菌數量逐年減少，真菌數量逐年增加。

2.4 ?土壤年限與萵苣根長、土壤理化指標及微生物數量的相關性分析

相關性分析結果表明（表3），百香果種植土壤的年限與pH、細菌、放線菌數量呈現極顯著負相關，即隨著土壤年限增加，該指標呈顯著下降趨勢;而與土壤有效氮、有效磷、有效鉀含量及真菌數量呈顯著或極顯著正相關，即隨著土壤年限的增加呈顯著上升趨勢。萵苣根長與土壤pH和細菌、放線菌數量呈顯著正相關，而與真菌數量呈顯著負相關。其次，pH與土壤有效氮、有效鉀含量及真菌數量呈顯著或極顯著負相關，而與細菌、放線菌數量呈顯著或極顯著正相關。可見，隨著土壤年限的增加，百香果根際土壤酸化加劇，土壤中有效性養(yǎng)分含量增加，土壤中的細菌數量下降，真菌數量上升，對萵苣的抑制作用增強。

2.5 ?百香果根際土壤真菌的分離、鑒定及侵染效果評價

以種植3 a的百香果根際土壤為材料，分離培養(yǎng)百香果根際土壤真菌，成功分離并純化9種不同類型的真菌（圖3），分別標記為BXG 1～BXG 9。將分離獲得的真菌接種到百香果組培苗上，在無菌條件下進行培養(yǎng)與觀察，發(fā)現與對照相比，菌株BXG 3、BXG 7、BXG 9感染后的百香果長勢明顯下降（圖4）?？梢?，菌株BXG 3、BXG 7、BXG 9可影響百香果的正常生長。

進一步對菌株BXG 3、BXG 7、BXG 9進行鑒定，結果表明，BXG 3菌落白色，蓬松凸起，棉絮狀，培養(yǎng)基反面為深黃色，具有大、小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，無色透明，大小為21.3～50.1 μm × 2.2～4.7 μm，小型分生孢子呈梨形或腎形，無色透明，大小為5.4～ 13.2?μm × 2.1～4.5 μm。BXG 3序列長度532 bp，與層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的同源性達99%。形態(tài)學與分子鑒定結果表明，BXG 3屬于鐮刀菌屬的層出鐮刀菌。BXG 7菌落絮狀，羊毛狀白色至淺灰色，培養(yǎng)基反面為淺茶色至黑色，有末端生厚壁孢子及間生厚壁孢子，大小分別為4.3～5.6?μm×5.4～7.6?μm和3.9～5.5?μm×5.2～7.1?μm。BXG?7序列長度541 bp，與棕黑腐質霉菌（Humicola fuscoatra）的同源性達99%。形態(tài)學與分子鑒定結果表明，BXG 7屬于腐質霉屬的棕黑腐質霉菌。BXG 9菌落呈圓形至貝殼狀，有細長毛和絨毛，培養(yǎng)基反面為灰褐色至灰黑色至黑色，孢子無色，光滑，長橢圓形，大小為4.3～6.9?μm× 1.5～2.5?μm。BXG 9序列長度603?bp，與毛栓菌（Trametes hirsuta）的同源性達99%。形態(tài)學與分子鑒定結果表明，BXG 9屬于栓菌屬的毛栓菌。

3 ?討論

土壤作為植物養(yǎng)分吸收及儲藏的載體，土壤肥力指標的變化對于植物的生長、產量及品質具有一定的影響。本研究結果表明，隨著百香果種植年限的增加，土壤的pH呈顯著下降趨勢，總氮、總磷、總鉀等含量變化較小，有效氮、有效磷、有效鉀及有機質含量呈上升趨勢。相關性分析表明，百香果種植年限與pH呈極顯著負相關，而與土壤有效氮、有效磷、有效鉀含量呈顯著或極顯著正相關。據報道，作物連作極易導致土壤酸化，可提高土壤速效氮、磷、鉀的含量，但也容易導致其流失，而對全氮、全磷、全鉀影響則較小[22-24]?？梢姡S著百香果連作年限的增加，土壤酸化程度加劇，土壤中有效性養(yǎng)分增加。

土壤有效性養(yǎng)分增加對于植物的生長是有利的，然而本研究發(fā)現，隨著百香果種植年限的增加，土壤對受體的抑制作用增強，自毒潛力加劇。Wang等[13]研究發(fā)現，隨著百香果連作年限的增加，百香果產量和品質呈下降趨勢?？梢?，雖然百香果連作土壤有效性養(yǎng)分增加，但受土壤酸化的影響，以及自毒潛力的增加，百香果對養(yǎng)分的吸收或利用效率下降，進而影響其生長。這種影響是否與土壤中的微生物存在一定的關系。據報道，中性偏堿的土壤環(huán)境較適合細菌、放線菌的繁殖與生長，而真菌則偏向于中性偏酸環(huán)境[25-26]。Latz等[27]研究發(fā)現，作物生物群落多樣性提高，可促進作物根際土壤有益菌的生長，抑制土傳病害傳播。惡劣環(huán)境條件下，真菌比細菌具有更強的生命力[28]，而連作極易導致細菌數量減少、真菌數量增加，進而導致地力衰竭，病蟲害加劇[29]。本研究發(fā)現，隨著百香果種植年限的增加，百香果根際土壤的細菌、放線菌數量呈下降趨勢，真菌數量呈上升趨勢。相關性分析表明，百香果種植年限與pH、細菌、放線菌數量呈極顯著負相關，而與真菌數量呈顯著或極顯著正相關。土壤pH與土壤真菌數量呈顯著負相關，而與細菌、放線菌數量呈顯著或極顯著正相關?？梢姡S著百香果種植年限的增加，百香果根際土壤酸度增強，土壤細菌、放線菌數量下降，真菌數量上升，土壤微生物從細菌型向真菌型轉化，進而導致百香果生長發(fā)育不良。

在上述研究的基礎上，進一步從種植3 a的百香果根際土壤分離真菌并對其侵染百香果能力進行評價，結果表明，共分離、純化獲得9個真菌菌株，將菌株回接種至百香果組培苗中進行侵染測定，發(fā)現被菌株BXG 3、BXG 7、BXG 9侵染后的百香果苗長勢與對照相比明顯下降。鑒定結果表明，菌株BXG 3、BXG 7、BXG 9分別為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、棕黑腐質霉菌（Humicola?fuscoatra）和毛栓菌（Trametes hirsuta）。據報道，層出鐮刀菌是引起根腐病的病原菌，在染病的雜草黑燕麥中也曾分離到該病原菌[30-31]。高玉峰[32]研究連作蔬菜根際土壤真菌多樣性時，從土壤中分離出61種病原真菌，其中包含了棕黑腐質霉菌。而毛栓菌則具有極強的木質素纖維降解能力，極易導致植物根系被快速降解，降低植物根系的生長能力[33-34]。由此可見，百香果連作后，土壤中存在的毛栓菌可快速降解和分離植物根系，降低根系的抵抗力，使其更容易讓病原真菌——層出鐮刀菌和棕黑腐質霉菌侵染，進而降低百香果對養(yǎng)分的吸收能力，導致百香果病害加劇，生長受阻。

綜上所述，隨著百香果連作年限的增加，土壤pH值降低，酸化程度加劇，土壤自毒潛力加強，土壤微生物從細菌型向真菌型轉化，更利于土壤病原菌的繁殖與侵染，進而影響百香果的生長。

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