外源鈣及其抑制劑對(duì)蝴蝶蘭幼苗耐熱性的影響

楊華庚 楊毅敏

摘 ?要：為探討Ca2+信號(hào)參與調(diào)節(jié)蝴蝶蘭耐熱性形成的生理機(jī)制，采用適宜濃度的外源Ca2+（CaCl2）、胞外Ca2+螯合劑（EGTA）和質(zhì)膜Ca2+通道抑制劑（LaCl3）溶液噴施蝴蝶蘭幼苗植株，以噴施蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗植株的抗氧化酶活性、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和光合色素含量的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，CaCl2處理能顯著增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，增加脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，顯著降低丙二醛含量，減輕了蝴蝶蘭幼苗的高溫傷害，而LaCl3和EGTA處理不同程度地降低SOD、POD和CAT活性，降低脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，顯著增加丙二醛含量，使蝴蝶蘭幼苗受害加重。由此認(rèn)為，Ca2+信號(hào)可通過(guò)參與抗氧化酶活性、脯氨酸和光合色素的代謝過(guò)程來(lái)調(diào)控蝴蝶蘭幼苗耐熱性的形成。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭;鈣離子信號(hào);耐熱性;生理機(jī)制

Abstract： The objective of the study is to explore the underlying physiological mechanism of Ca2+ signal participating in the enhancement of Phalaenopsis heat tolerance. The seedlings of Phalaenopsis were sprayed appropriate concentration of exogenous calcium （Ca2+）， extracellular Ca2+ chelator （EGTA） and plasma membrane Ca2+ channel inhibitor （LaCl3） respectively， taking distilled water as the control. The effects of antioxidant enzyme activity， malondialdehyde （MDA）， osmotic regulators and photosynthetic pigment contents in Phalaenopsis leaves under high temperature stress were investigated. The results showed that SOD， POD and CAT activities， proline， soluble sugar， soluble protein， total chlorophyll and carotenoids contents were significantly increased and MDA content was significantly reduced in the CaCl2 treatment group， stress damages in Phalaenopsis seedlings caused by high temperature were alleviated. while the activities of three antioxidant enzymes and contents of three osmoregulation substances and contents of two photosynthetic pigments mentioned above were decreased to different extents and MDA content was significantly improved in LaCl3 and EGTA treatments group compared with the control group， thereby aggravating the damage of high temperature stress in Phalaenopsis seedlings. The study showed that Ca2+ signaling could improve the resistance of Phalaenopsis seedlings to high temperature stress by participating in antioxidant enzyme activity， proline and photosynthetic pigment metabolism processes.

Keywords： Phalaenopsis; Ca2+ signal; heat tolerance; physiological mechanism

蝴蝶蘭（Phalaenopsis ssp.）是具有較高觀賞性和商業(yè)價(jià)值的熱帶附生蘭花。其生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)高溫敏感，易受高溫的抑制和危害，不利于蝴蝶蘭植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此，應(yīng)用外源Ca2+等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)提高蝴蝶蘭耐熱性對(duì)蝴蝶蘭抗熱性栽培具有重要的生產(chǎn)意義。Ca2+是植物體生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)元素，不僅可作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分、生物膜的穩(wěn)定劑和多種酶的活化劑影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而且還作為偶聯(lián)胞外信號(hào)與胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使，參與植物對(duì)高溫等逆境的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。高溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度會(huì)顯著升高[2-3]，而形成的胞內(nèi)外Ca2+濃度差會(huì)產(chǎn)生鈣信號(hào)。Ca2+與其受體蛋白CaM（鈣調(diào)素蛋白）結(jié)合后，能啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)熱激蛋白的合成，調(diào)節(jié)一系列的生理代謝過(guò)程來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)高溫的適應(yīng)性[1， 4]。研究發(fā)現(xiàn)，外源Ca2+處理能提高菊花[5]、茄子[6]、辣椒[7-8]等植物的抗熱性，而Ca2+螯合劑（EGTA）和質(zhì)膜Ca2+通道阻抑劑（LaCl3）處理能不同程度地降低番茄[9]、辣椒[7]等植物的抗熱性。說(shuō)明Ca2+信號(hào)參與植物抗熱性的調(diào)控，其作用機(jī)制可通過(guò)穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，維持較高Ca2+-ATP酶活性[8]，參與調(diào)節(jié)熱激蛋白的基因表達(dá)和熱激蛋白合成[2， 10]，維持較高的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量[7， 11]，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累[12-13]，提高光合作用[12]等生理過(guò)程來(lái)增強(qiáng)植物的抗熱性。雖然外源Ca2+處理能顯著提高蝴蝶蘭幼苗的耐熱性[14]，但目前還缺少Ca2+信號(hào)是否參與蝴蝶蘭耐熱性調(diào)控的相關(guān)證據(jù)。本研究采用適宜濃度的CaCl2、EGTA和LaCl3溶液噴施蝴蝶蘭幼苗植株，測(cè)定高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗植株的抗氧化酶活性、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和光合色素含量的變化，初步探討Ca2+信號(hào)是否參與蝴蝶蘭耐熱性的調(diào)控，為生產(chǎn)上應(yīng)用外源Ca2+提高蝴蝶蘭耐熱性提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

為生長(zhǎng)健壯，無(wú)病蟲(chóng)危害的4葉齡蝴蝶蘭品種‘滿(mǎn)天紅（Dtps. Queen Beer ‘Red Sky）的幼苗植株，購(gòu)自海南博大蘭花有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì) ?選取高度、長(zhǎng)勢(shì)、葉色基本一致的適量幼苗植株放入溫度為27?℃（晝）/22?℃（夜），相對(duì)濕度為65%～75%，光照強(qiáng)度為230?mol/（m2·s）的生物培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理，期間適當(dāng)澆水以保持基質(zhì)濕潤(rùn)，5 d后取出幼苗植株進(jìn)行試驗(yàn)處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)高溫脅迫+蒸餾水（CK）;高溫脅迫+20 mmol/L CaCl2;高溫脅迫+5 mmol/L EGTA;高溫脅迫+5?mmol/L LaCl3 4個(gè)處理，每個(gè)處理9株苗，3次重復(fù)。將含0.1% Tween-80，pH 6.8的各處理溶液于傍晚時(shí)分均勻噴施于蝴蝶蘭幼苗葉片的正反面，以欲滴為度，連續(xù)噴灑3 d，然后將所有處理植株置于溫度為（40±1）℃、相對(duì)濕度為65%～75%、光照強(qiáng)度為230?mol/（m2·s）的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行3?d脅迫處理，脅迫結(jié)束后立即取出植株，剪下頂端最近充分成熟的葉片，依次用自來(lái)水和蒸餾水洗凈后，經(jīng)干凈紗布擦干，去掉葉片粗大的主脈，剪取葉樣，充分混勻，用于測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2.2 ?抗氧化酶活性測(cè)定 ?粗酶液按文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行提取。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，參照李合生[15]的方法測(cè)定，以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位（U），以U/（g·h）表示。過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法，參照鄭炳松[16]的方法測(cè)定，以每分鐘吸光度增加0.01為1個(gè)酶活性單位，以U/（g·min）表示。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光法，參照孔祥生等[17]的方法測(cè)定，以每分鐘吸光度減少0.01為1個(gè)酶活性單位，以U/（g·min）表示。

1.2.3 ?丙二醛含量測(cè)定 ?采用硫代巴比妥酸法，參照孔祥生等[17]的方法測(cè)定。

1.2.4 ?滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定 ?脯氨酸含量采用酸性茚三酮法;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法;可溶性糖含量采用蒽酮比色法，參照李合生[15]的方法測(cè)定。

1.2.5 ?光合色素含量測(cè)定 ?葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量采用無(wú)水乙醇和丙酮等體積混合提取液法，參照張憲政[18]的方法測(cè)定。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，采用SPSS 17.0軟件的Duncans多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?CaCl2、EGTA和LaCl3對(duì)蝴蝶蘭幼苗葉片膜脂過(guò)氧化的影響

丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低能反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度。由圖1所示，CaCl2處理顯著降低高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗的丙二醛含量，比對(duì)照的減少24.5%，說(shuō)明Ca2+處理能減輕高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗的膜脂過(guò)氧化水平。而LaCl3和EGTA處理極顯著或顯著增加高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗的丙二醛含量，比對(duì)照的分別增加69.7%和19.2%。相比之下，LaCl3處理的膜脂過(guò)氧化程度比EGTA處理的更為強(qiáng)烈。說(shuō)明LaCl3和EGTA處理加重了蝴蝶蘭幼苗的膜脂過(guò)氧化傷害。

2.2 ?CaCl2、EGTA和LaCl3對(duì)蝴蝶蘭幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的重要抗氧化酶，SOD負(fù)責(zé)清除，而POD、CAT負(fù)責(zé)清除H2O2，其活性高低可反映細(xì)胞抗氧化能力的強(qiáng)弱。從圖2可看出，高溫脅迫下，CaCl2處理極顯著提高蝴蝶蘭幼苗葉片的SOD、POD、CAT活性，比對(duì)照的分別增加了39.0%、24.5%、26.9%，表明Ca2+處理能提高蝴蝶蘭幼苗清除活性氧的能力，減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的氧化傷害。而EGTA和LaCl3處理均會(huì)顯著降低蝴蝶蘭幼苗葉片的SOD、POD、CAT活性，其中，EGTA處理的SOD、POD、CAT活性分別比對(duì)照的減少18.3%、22.3%、42.2%，LaCl3處理的SOD、POD、CAT活性分別比對(duì)照的減少34.3%、12.9%、28.1%。說(shuō)明EGTA和LaCl3處理明顯降低蝴蝶蘭幼苗的抗氧化能力，加重了高溫對(duì)植株的氧化傷害。但二者的抑制效應(yīng)不同，EGTA處理對(duì)CAT活性的抑制作用最強(qiáng)，而LaCl3處理對(duì)SOD活性的抑制作用最強(qiáng)。

2.3 ?CaCl2、EGTA和LaCl3對(duì)蝴蝶蘭幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖是植物細(xì)胞內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，有利于增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，減輕逆境對(duì)細(xì)胞的傷害。高溫脅迫下，CaCl2處理顯著增加蝴蝶蘭幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量，分別比對(duì)照的增加11.3%、15.7%、218.1%。表明Ca2+處理能通過(guò)提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力緩解高溫對(duì)蝴蝶蘭幼苗的傷害。而EGTA和LaCl3處理對(duì)可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖積累的抑制效應(yīng)不同。EGTA處理極顯著降低脯氨酸含量，但不會(huì)顯著降低可溶性蛋白和可溶性糖含量。LaCl3處理均能顯著降低脯氨酸和可溶性糖含量，但不會(huì)顯著降低可溶性蛋白含量（圖3）。說(shuō)明EGTA和LaCl3處理能減弱蝴蝶蘭幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，使其易受高溫傷害。

2.4 ?CaCl2、EGTA和LaCl3對(duì)蝴蝶蘭幼苗光合色素含量的影響

葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素是植物的2類(lèi)重要光合色素，其含量多少與光能吸收密切相關(guān)，能在一定程度上反映光合作用的強(qiáng)弱。如圖4所示，高溫脅迫下，CaCl2處理的蝴蝶蘭幼苗葉片的總?cè)~綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量極顯著增加，分別比對(duì)照的增加101.6%和149.7%?？梢?jiàn)，Ca2+處理可通過(guò)增加光合色素的合成來(lái)增強(qiáng)光合能力，提高蝴蝶蘭幼苗對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性。EGTA處理極顯著降低總?cè)~綠素含量，但對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的抑制作用不顯著。LaCl3處理的總?cè)~綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量分別比對(duì)照的減少14.9%和27.1%，二者的下降均未達(dá)到顯著差異水平。表明EGTA和LaCl3處理會(huì)抑制總?cè)~綠素和類(lèi)胡蘿卜素合成，甚至促進(jìn)其降解，從而降低光合能力，減弱蝴蝶蘭幼苗對(duì)高溫脅迫的抵御作用。

3 ?討論

高溫脅迫下，Ca2+處理能促使更多的胞外Ca2+通過(guò)質(zhì)膜鈣離子通道進(jìn)入胞內(nèi)，明顯增加胞內(nèi)的Ca2+含量[3]，從而促進(jìn)CaM基因表達(dá)，增加CaM蛋白含量，Ca2+與CaM結(jié)合形成鈣-鈣調(diào)素（Ca2+-CaM）信號(hào)系統(tǒng)，參與植物熱激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+處理明顯降低高溫脅迫下辣椒幼苗的質(zhì)膜透性，而La3+和EGTA處理會(huì)增加辣椒幼苗的質(zhì)膜透性[7]。本研究中，CaCl2處理顯著降低高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗的丙二醛含量，而LaCl3和EGTA處理顯著增加丙二醛含量，說(shuō)明外源Ca2+能減輕高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗膜脂過(guò)氧化作用，緩解質(zhì)膜系統(tǒng)的損傷，提高了質(zhì)膜的穩(wěn)定性，在一定程度上提高了蝴蝶蘭幼苗的耐熱性，而LaCl3和EGTA處理加劇蝴蝶蘭幼苗膜脂過(guò)氧化作用，破壞質(zhì)膜的完整性，降低了蝴蝶蘭幼苗的耐熱性。進(jìn)一步證明Ca2+信號(hào)參與調(diào)控蝴蝶蘭等植物的耐熱性。

高溫脅迫下活性氧的產(chǎn)生與清除失衡，引發(fā)活性氧的過(guò)量積累，從而激活SOD、POD、CAT活性，三者相互協(xié)同共同清除過(guò)量的活性氧，減輕了細(xì)胞的過(guò)氧化傷害，使質(zhì)膜系統(tǒng)維持相對(duì)穩(wěn)定性，提高了植物的抗熱性[19]。SOD、POD和CAT受Ca2+-CaM信號(hào)系統(tǒng)的誘導(dǎo)和調(diào)控[6]，例如，Ca2+與CaM結(jié)合能激活SOD活性[20]和CAT活性[21]。研究表明，外源Ca2+處理維持高溫脅迫下玉米幼苗相對(duì)較高的SOD、CAT、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性，而EGTA處理能使SOD、CAT、APX快速失去活性[11];Ca2+處理能抑制高溫脅迫下辣椒葉片抗氧化物質(zhì)抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的氧化破壞，使其維持在相對(duì)較高的水平，而EGTA和La3+處理促使辣椒AsA和GSH含量降低[7]。本研究表明，CaCl2處理顯著提高高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗的SOD、POD、CAT活性，而EGTA和LaCl3處理顯著降低高溫脅迫下SOD、POD、CAT活性，說(shuō)明外源Ca2+處理提高了抗氧化酶系統(tǒng)清除蝴蝶蘭幼苗活性氧的能力，明顯降低細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化傷害，增強(qiáng)其耐熱性，而EGTA和LaCl3處理使蝴蝶蘭幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)受到抑制，加重了蝴蝶蘭幼苗的高溫傷害。表明Ca2+信號(hào)可通過(guò)參與調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)調(diào)控蝴蝶蘭耐熱性的形成。

滲透調(diào)節(jié)是植物防御高溫脅迫的重要機(jī)制。高溫脅迫下，植物體內(nèi)大量積累可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能在一定程度上降低細(xì)胞水勢(shì)，防止細(xì)胞內(nèi)脫水，維持體內(nèi)水分平衡，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能，提高植物對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性[22]。有研究表明，脯氨酸的積累與茄子的耐熱性呈顯著正相關(guān)[23]。適宜濃度CaCl2處理能促進(jìn)高溫脅迫下百合脯氨酸和可溶性蛋白的大量積累，而EGTA處理明顯降低百合脯氨酸和可溶性蛋白含量[12]。短期熱脅迫下，Ca2+處理可使番茄幼苗及其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量增加，而EGTA或La3+處理卻使脯氨酸含量下降[13]。本研究中，CaCl2處理能顯著或極顯著增加高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖積累，而EGTA和LaCl3處理極顯著降低脯氨酸含量，LaCl3處理顯著降低可溶性糖含量，表明Ca2+信號(hào)主要是通過(guò)參與調(diào)節(jié)高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗脯氨酸合成和積累來(lái)緩解高溫對(duì)其的傷害。高溫脅迫下，CaCl2處理顯著增加了蝴蝶蘭幼苗葉片的可溶性蛋白含量，而EGTA和LaCl3處理不同程度地降低了可溶性蛋白含量，這可能是由于Ca2+能促進(jìn)熱激蛋白基因表達(dá)和熱激蛋白合成，而EGTA和LaCl3卻能降低熱激蛋白基因表達(dá)和熱激蛋白合成所致[2， 10]。熱激蛋白合成，能維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受高溫傷害[2]。

葉綠素是植物吸收光能的主要物質(zhì)，直接影響植物光合作用的光能利用[24]。類(lèi)胡蘿卜素除吸收光能外，還可作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑，起吸收過(guò)剩光能，猝滅活性氧，防止膜脂過(guò)氧化作用[22]。高溫脅迫下，適宜濃度的Ca2+處理能減輕花生幼苗的光系統(tǒng)損傷，增加光合膜的穩(wěn)定性[25]，顯著增加皖貝母葉片葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，明顯提高光合效率[22]。研究發(fā)現(xiàn)，CaCl2處理能減緩高溫脅迫下百合葉片的葉綠素降解，使葉綠素含量始終高于對(duì)照，而EGTA和CaM抑制劑三氟拉嗪（TFP）處理卻促進(jìn)葉綠素的降解，使葉綠素含量始終低于對(duì)照[12]。本研究中，CaCl2處理極顯著增加了高溫脅迫下蝴蝶蘭幼苗葉片的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，而EGTA和LaCl3處理不同程度地降低了葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量，說(shuō)明CaCl2處理提高了高溫脅迫下蝴碟蘭的光合能力，有利于增強(qiáng)蝴蝶蘭幼苗對(duì)高溫的適應(yīng)性，而EGTA和LaCl3處理降低了光合產(chǎn)物的合成，減弱了蝴蝶蘭幼苗對(duì)高溫的耐受性。說(shuō)明Ca2+信號(hào)可通過(guò)參與調(diào)節(jié)光合色素的代謝過(guò)程來(lái)調(diào)控蝴蝶蘭幼苗耐熱性的形成。

綜上所述，本研究初步認(rèn)為，Ca2+信號(hào)可通過(guò)參與調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、脯氨酸和光合色素代謝過(guò)程來(lái)增強(qiáng)蝴蝶蘭幼苗的耐熱性。但有關(guān)Ca2+信號(hào)調(diào)控蝴蝶蘭幼苗耐熱性的形成機(jī)制有待于從分子機(jī)制上進(jìn)一步加以揭示。

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