芒果MiFY基因克隆和表達模式分析

范志毅 羅聰 余海霞 曾學梅 王金英 謝小杰 何新華

摘 ?要：FY是擬南芥自主途徑中調(diào)控成花的基因，F(xiàn)Y通過與RNA結(jié)合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）相互作用下調(diào)成花抑制基因FLOWERING LOUS C （FLC）的表達從而促進開花。目前關于FY基因如何調(diào)控芒果成花的機制尚無研究報道。通過挖掘芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得1個FY基因，命名為MiFY。生物信息學分析顯示，MiFY基因的ORF全長為2178?bp，編碼725個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為799.59?kDa，理論等電點為8.72，氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30兩個保守結(jié)構(gòu)域?；虮磉_模式分析顯示，MiFY基因在2個芒果品種的開花期均具有較高的表達水平，而在營養(yǎng)生長期表達水平較低。因此推測MiFY基因可能在調(diào)節(jié)芒果成花中起著重要作用。

關鍵詞：芒果;開花基因;FY;克隆;表達模式

Abstract： FY is a flowering gene in the autonomous pathway of Arabidopsis thaliana. The expression of the flower suppressor gene FLC is down regulated by interaction with the RNA binding protein FLOWERING CONTROL LOCUS （FCA）. The mechanism of how FY gene regulating the flower formation in mango has not been studied. In the study， a FY homologous gene was obtained from the transcriptome data of mango， named MiFY. Sequences analysis showed that the open reading frame of the gene had 2178?bp which encoding 725 amino acids. The molecular weight was 799.59?kDa and isoelectric point was 8.72， respectively. Conserved domain analysis showed that FY protein contained two conserved domains， WD40 and Cytadhesin_P30. Expression analysis showed that MiFY expressed in all tested tissues but with expression level differences. MiFY gene was higher expressed during the flowering development period and lower expressed during the vegetative growth period. The results indicated that MiFY gene may play an important role in regulating mango flowering.

Keywords： mango; flowering gene; FY; cloning; expression pattern

成花轉(zhuǎn)變是高等植物生長發(fā)育重要的生理過程之一。通過對模式植物擬南芥成花分子機制的研究發(fā)現(xiàn)，參與植物成花調(diào)控的途徑包括光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、年齡依賴途徑、溫敏途徑和自主途徑[1]。在沒有外源開花信號誘導的條件下，植物的營養(yǎng)生長達到一定階段后也會開花的途徑叫做自主途徑[2]。其中，擬南芥的自主途徑通過下調(diào)成花抑制基因FLOWERING LOUS C（FLC）的表達而促進開花[3]。目前自主途徑至少包括7個基因：FY、FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）、FLOWERING LOCUS D （FLD）、FLOWERING LOCUS K （FLK）、LUMINIDEPENDENS （LD）、FPA、FVE，任何一個基因的突變都會增加FLC的表達，導致開花延遲[4-5]。其中，F(xiàn)Y基因作為一個高度保守的開花時間調(diào)控基因，是一個具有特殊C末端的真核蛋白聚腺苷酸化特異性因子（leavage and polyadenylation specificity factor，CPSF）復合物的亞單位，F(xiàn)Y基因的C末端有2個植物獨有的Pro-Pro-Leu-Pro-Pro（PPLPP）結(jié)構(gòu)域，可與FCA-WW結(jié)構(gòu)域相互作用形成復合體，F(xiàn)CA/FY復合體是RNA 3端的剪切因子，可調(diào)節(jié)FLC前體mRNA 3端剪切，抑制FLC基因的表達從而提早開花[6-8]，也可在缺少FCA的情況下自主抑制FLC基因的表達[9]。因此，F(xiàn)Y基因?qū)τ谥参锏拈_花調(diào)控極其重要。目前已克隆出少數(shù)木本植物FY同源基因，但進一步的功能研究還較少。

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹科芒果屬果樹，是世界著名熱帶果樹，其較長的童期是芒果新品種選育的最大障礙。目前在芒果成花研究中已有FLOWERING LOCUS T （FT）、CONSTANS （CO）、APETALA1 （AP1）等成花基因的相關研究[10-13]，但還沒有關于FY基因的報道。本研究以廣西地區(qū)一年能夠多次成花多次結(jié)果（4～5次）的‘四季蜜芒和一年開花結(jié)果一次的‘臺農(nóng)一號芒為供試材料，克隆獲得MiFY基因，對其序列進行生物信息學分析，同時通過實時熒光定量對其時空和組織表達進行分析，以明確MiFY基因的序列特征及在2個具有不同成花習性芒果品種正?；òl(fā)育不同時期的表達模式，為深入研究FY基因在調(diào)控芒果成花過程中的功能奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為16年生‘四季蜜芒和‘臺農(nóng)一號芒，種植于廣西大學農(nóng)學院果樹標本園。組織表達特性和年周期樣品采集分別為2018年11月5日、12月5日，以及2019年1月4日和29日、3月6日的‘四季蜜芒和‘臺農(nóng)一號芒的成熟葉、成熟莖和芽/花。采樣時間統(tǒng)一定為17：00—18：00，樣品采集后立即放入?80?℃冰箱冷凍保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA的提取及cDNA的合成 ?采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAperp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取芒果RNA，方法參考試劑盒說明書。逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，用雙蒸水稀釋cDNA濃度至100?ng/μL，保存于?40?℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?MiFY基因的克隆與序列信息分析 ?以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)前期芒果轉(zhuǎn)錄組測序獲得的MiFY基因序列設計特異引物。其中正向引物為MiFYu（5-ATGATGT ACGC TGA T CCTCA-3），反向引物為MiFYd（5-CCTACTGC GGCGTTTGGCTA-3）。PCR體系為25?μL，擴增程序為：95?℃預變性3?min;95?℃變性40?s，54?℃退火40?s，72?℃延伸150?s，36個循環(huán);最后在72?℃下延伸10?min。用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將目標片段利用膠回收試劑盒進行純化，并連接至pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。涂板后挑選單菌落進行菌落PCR檢測，經(jīng)篩選的陽性克隆被送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。為了預測MiFY蛋白的生物學功能，在NCBI數(shù)據(jù)庫的Conserved Domain Search中搜索MiFY蛋白同源序列。利用DNAMAN 8.0軟件進行同源氨基酸序列比對，然后用鄰接法（Neighbour-Joining， N-J）進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 ?MiFY基因時空和組織特異性表達分析 ?根據(jù)MiFY基因序列設計熒光定量PCR引物。正向引物為qMiFYu（5-CATCAGCAGAATCAG CCGCAG-3），反向引物為qMiFYd（5-GA G TAGTGGACGAGGCAGACG-3）。以芒果Actin1為內(nèi)參基因[14]，引物為qActinu（5-CCGAGACAT GAAGGAGAAGC-3），qActind（5-GTGG TC TCATGGATACGAGCA-3）。實時熒光定量PCR儀器為ABI7500。擴增反應體系和程序參照試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）說明書進行。以50?ng/?L的cDNA為模板，反應總體系為20??L，其中cDNA 1.5??L，上下游引物各0.5??L，SYBRⅡ 10??L，ROXⅡ 0.4??L，超純水7.1??L。PCR程序為：95?℃ 30?s;95?℃ 5?s，60?℃ 34?s，95?℃ 15?s，60?℃ 1?min，40個循環(huán);95?℃ 15?s。采用2?ΔΔCT法計算相對表達水平[15]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?MiFY基因的克隆

在前期轉(zhuǎn)錄組研究中，獲得了1個FY基因的全長。為了驗證FY基因序列的正確性，設計了能夠擴增基因全長編碼區(qū)的特異引物，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，通過RT-PCR法克隆‘四季蜜芒MiFY基因，電泳檢測顯示成功獲得1條長度約為2200?bp的條帶，與目的條帶大小一致（圖1）。將克隆結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得的序列長度為2178?bp，與轉(zhuǎn)錄組獲得的序列一致。

2.2 ?MiFY基因生物信息學分析

利用IBS 1.0軟件描述MiFY蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，MiFY由7個連續(xù)重復的WD40和2個PPLPP結(jié)構(gòu)域組成（圖2）。利用DNAMAN 8.0將MiFY與柑橘、橡膠樹等其他植物的氨基酸序列進行比對，其中，單下劃線為WD40結(jié)構(gòu)域，雙下劃線為PPLPP結(jié)構(gòu)域（圖3）。為了分析MiFY的親緣關系，使用DNAMAN 8.0的N-J方法進行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果顯示，芒果MiFY與柑橘CsFY1同源性最高，氨基酸相似性為86.48%，在進化上和柑橘（CsFY）、蓖麻（RcFY）較為接近，同源性分別為86.07%、84.17%。由此可確定克隆所得基因為芒果FY同源基因MiFY，GenBank登錄號為MT199952。

2.3 ?MiFY基因表達模式分析

為了探討MiFY基因在不同組織和不同成花時期的表達模式，在芒果成花不同發(fā)育時期，分別采集莖、葉和芽/花為材料進行熒光定量檢測（圖5），結(jié)果表明，在‘四季蜜芒中，F(xiàn)Y基因在各個測試組織的各個時期均表達，但在芒果的成花誘導期之前表達水平偏低，而誘導期之后表達水平迅速上升，其中在成熟葉和芽中的上升水平高于成熟莖中的表達。MiFY基因的最高表達高峰出現(xiàn)在開花期的成熟葉中，其次是在花芽分化期的頂芽中。在‘臺農(nóng)一號芒中，MiFY基因模式與在‘四季蜜芒中的表達情況類似，均在成花誘導期之前表達水平很低，但其表達高峰主要出現(xiàn)在花芽分化后期和成花期，MiFY基因的最高表達高峰出現(xiàn)在花芽分化期的頂芽中，其次是在花芽分化期的成熟莖中，而在開花期的花中也有很高的表達水平。在2個不同的品種中，MiFY基因的整體表達趨勢類似，但又存在著組織表達差異。

3 ?討論

近年來，借助擬南芥突變體，影響植物成花的很多基因被挖掘出來，植物成花調(diào)控網(wǎng)絡的研究也越來越深入。與模式植物擬南芥相比，木本果樹具有較長的童期，嚴重影響果樹的育種進程，因此對果樹成花基因的挖掘與功能研究對縮短木本果樹的童期具有重要意義。FY基因作為自主途徑中調(diào)控植物成花的重要基因，其具有多重功能。據(jù)報道，F(xiàn)Y基因的主要功能是正確定位成花抑制基因FLC的多腺苷化而控制開花時間[9]。FY作為FLC的激活劑和抑制劑在調(diào)控開花時間中具有雙重作用，可與FCA相互作用抑制FLC活性，也可通過激活FLC的表達而延遲開花[16]。此外，F(xiàn)Y在種子休眠、ABA響應、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮作用[17-18]。最新研究結(jié)果表明，F(xiàn)Y在mRNA多腺苷化中具有保守性和特異性功能[19]。因此，研究和闡明FY基因在開花途徑中的調(diào)控機理，對探索木本植物花期調(diào)控具有重要意義。

目前，F(xiàn)Y基因的功能研究僅在少數(shù)單子葉植物（水稻、黑麥草、蝴蝶蘭）和雙子葉植物（擬單南芥）中[20-21， 23]，在木本植物中的調(diào)控機制尚未見系統(tǒng)報道。鑒于此，本研究在前期已完成芒果轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上，成功獲得1個FY同源基因，采用RT-PCR技術從‘四季蜜芒中克隆得到了MiFY的編碼區(qū)序列，對其氨基酸序列特性和蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，并分析MiFY在2個芒果品種中的表達模式。結(jié)果顯示，MiFY包含7個WD重復區(qū)域和2個PPLPP保守結(jié)構(gòu)域，與前人報道相同[20， 22]。其中，第一個PPLPP保守結(jié)構(gòu)域在C端區(qū)高度保守，與前人研究結(jié)果一致[7]。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，芒果的MiFY與柑橘進化關系最近，它們都屬于木本植物，這符合植物各科屬在進化中的關系。黃玉婷[23]研究發(fā)現(xiàn)FY基因在蝴蝶蘭各個發(fā)育時期均表達，其中在第84天表達量最高，之后持續(xù)緩慢降低。本研究中MiFY基因在2個不同開花習性芒果品種的所有測試組織中均表達，但存在組織表達差異，并且發(fā)現(xiàn)MiFY基因在2個芒果品種成花期均大量表達，而在營養(yǎng)生長期表達水平較低，這與在蝴蝶蘭中的結(jié)果類似。因此可以推測MiFY基因在不同芒果品種的成花過程均發(fā)揮重要作用。

本研究通過對芒果MiFY基因的克隆、序列分析和基因表達模式分析，為進一步深入研究MiFY基因的功能奠定基礎。

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責任編輯：黃東杰