芒果MiFY基因克隆和表達(dá)模式分析

范志毅 羅聰 余海霞 曾學(xué)梅 王金英 謝小杰 何新華

摘 ?要：FY是擬南芥自主途徑中調(diào)控成花的基因，F(xiàn)Y通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）相互作用下調(diào)成花抑制基因FLOWERING LOUS C （FLC）的表達(dá)從而促進(jìn)開(kāi)花。目前關(guān)于FY基因如何調(diào)控芒果成花的機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道。通過(guò)挖掘芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得1個(gè)FY基因，命名為MiFY。生物信息學(xué)分析顯示，MiFY基因的ORF全長(zhǎng)為2178?bp，編碼725個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為799.59?kDa，理論等電點(diǎn)為8.72，氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。基因表達(dá)模式分析顯示，MiFY基因在2個(gè)芒果品種的開(kāi)花期均具有較高的表達(dá)水平，而在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表達(dá)水平較低。因此推測(cè)MiFY基因可能在調(diào)節(jié)芒果成花中起著重要作用。

關(guān)鍵詞：芒果;開(kāi)花基因;FY;克隆;表達(dá)模式

Abstract： FY is a flowering gene in the autonomous pathway of Arabidopsis thaliana. The expression of the flower suppressor gene FLC is down regulated by interaction with the RNA binding protein FLOWERING CONTROL LOCUS （FCA）. The mechanism of how FY gene regulating the flower formation in mango has not been studied. In the study， a FY homologous gene was obtained from the transcriptome data of mango， named MiFY. Sequences analysis showed that the open reading frame of the gene had 2178?bp which encoding 725 amino acids. The molecular weight was 799.59?kDa and isoelectric point was 8.72， respectively. Conserved domain analysis showed that FY protein contained two conserved domains， WD40 and Cytadhesin_P30. Expression analysis showed that MiFY expressed in all tested tissues but with expression level differences. MiFY gene was higher expressed during the flowering development period and lower expressed during the vegetative growth period. The results indicated that MiFY gene may play an important role in regulating mango flowering.

Keywords： mango; flowering gene; FY; cloning; expression pattern

成花轉(zhuǎn)變是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的生理過(guò)程之一。通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥成花分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，參與植物成花調(diào)控的途徑包括光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、年齡依賴途徑、溫敏途徑和自主途徑[1]。在沒(méi)有外源開(kāi)花信號(hào)誘導(dǎo)的條件下，植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)達(dá)到一定階段后也會(huì)開(kāi)花的途徑叫做自主途徑[2]。其中，擬南芥的自主途徑通過(guò)下調(diào)成花抑制基因FLOWERING LOUS C（FLC）的表達(dá)而促進(jìn)開(kāi)花[3]。目前自主途徑至少包括7個(gè)基因：FY、FLOWERING CONTROL LOCUS A （FCA）、FLOWERING LOCUS D （FLD）、FLOWERING LOCUS K （FLK）、LUMINIDEPENDENS （LD）、FPA、FVE，任何一個(gè)基因的突變都會(huì)增加FLC的表達(dá)，導(dǎo)致開(kāi)花延遲[4-5]。其中，F(xiàn)Y基因作為一個(gè)高度保守的開(kāi)花時(shí)間調(diào)控基因，是一個(gè)具有特殊C末端的真核蛋白聚腺苷酸化特異性因子（leavage and polyadenylation specificity factor，CPSF）復(fù)合物的亞單位，F(xiàn)Y基因的C末端有2個(gè)植物獨(dú)有的Pro-Pro-Leu-Pro-Pro（PPLPP）結(jié)構(gòu)域，可與FCA-WW結(jié)構(gòu)域相互作用形成復(fù)合體，F(xiàn)CA/FY復(fù)合體是RNA 3端的剪切因子，可調(diào)節(jié)FLC前體mRNA 3端剪切，抑制FLC基因的表達(dá)從而提早開(kāi)花[6-8]，也可在缺少FCA的情況下自主抑制FLC基因的表達(dá)[9]。因此，F(xiàn)Y基因?qū)τ谥参锏拈_(kāi)花調(diào)控極其重要。目前已克隆出少數(shù)木本植物FY同源基因，但進(jìn)一步的功能研究還較少。

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹(shù)科芒果屬果樹(shù)，是世界著名熱帶果樹(shù)，其較長(zhǎng)的童期是芒果新品種選育的最大障礙。目前在芒果成花研究中已有FLOWERING LOCUS T （FT）、CONSTANS （CO）、APETALA1 （AP1）等成花基因的相關(guān)研究[10-13]，但還沒(méi)有關(guān)于FY基因的報(bào)道。本研究以廣西地區(qū)一年能夠多次成花多次結(jié)果（4～5次）的‘四季蜜芒和一年開(kāi)花結(jié)果一次的‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)芒為供試材料，克隆獲得MiFY基因，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)其時(shí)空和組織表達(dá)進(jìn)行分析，以明確MiFY基因的序列特征及在2個(gè)具有不同成花習(xí)性芒果品種正?；òl(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式，為深入研究FY基因在調(diào)控芒果成花過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為16年生‘四季蜜芒和‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)芒，種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹(shù)標(biāo)本園。組織表達(dá)特性和年周期樣品采集分別為2018年11月5日、12月5日，以及2019年1月4日和29日、3月6日的‘四季蜜芒和‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)芒的成熟葉、成熟莖和芽/花。采樣時(shí)間統(tǒng)一定為17：00—18：00，樣品采集后立即放入?80?℃冰箱冷凍保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA的提取及cDNA的合成 ?采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAperp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取芒果RNA，方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，用雙蒸水稀釋cDNA濃度至100?ng/μL，保存于?40?℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?MiFY基因的克隆與序列信息分析 ?以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)前期芒果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的MiFY基因序列設(shè)計(jì)特異引物。其中正向引物為MiFYu（5-ATGATGT ACGC TGA T CCTCA-3），反向引物為MiFYd（5-CCTACTGC GGCGTTTGGCTA-3）。PCR體系為25?μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5?℃預(yù)變性3?min;95?℃變性40?s，54?℃退火40?s，72?℃延伸150?s，36個(gè)循環(huán);最后在72?℃下延伸10?min。用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將目標(biāo)片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，并連接至pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。涂板后挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，經(jīng)篩選的陽(yáng)性克隆被送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。為了預(yù)測(cè)MiFY蛋白的生物學(xué)功能，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Conserved Domain Search中搜索MiFY蛋白同源序列。利用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行同源氨基酸序列比對(duì)，然后用鄰接法（Neighbour-Joining， N-J）進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 ?MiFY基因時(shí)空和組織特異性表達(dá)分析 ?根據(jù)MiFY基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。正向引物為qMiFYu（5-CATCAGCAGAATCAG CCGCAG-3），反向引物為qMiFYd（5-GA G TAGTGGACGAGGCAGACG-3）。以芒果Actin1為內(nèi)參基因[14]，引物為qActinu（5-CCGAGACAT GAAGGAGAAGC-3），qActind（5-GTGG TC TCATGGATACGAGCA-3）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器為ABI7500。擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序參照試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以50?ng/?L的cDNA為模板，反應(yīng)總體系為20??L，其中cDNA 1.5??L，上下游引物各0.5??L，SYBRⅡ 10??L，ROXⅡ 0.4??L，超純水7.1??L。PCR程序?yàn)椋?5?℃ 30?s;95?℃ 5?s，60?℃ 34?s，95?℃ 15?s，60?℃ 1?min，40個(gè)循環(huán);95?℃ 15?s。采用2?ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平[15]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?MiFY基因的克隆

在前期轉(zhuǎn)錄組研究中，獲得了1個(gè)FY基因的全長(zhǎng)。為了驗(yàn)證FY基因序列的正確性，設(shè)計(jì)了能夠擴(kuò)增基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的特異引物，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR法克隆‘四季蜜芒MiFY基因，電泳檢測(cè)顯示成功獲得1條長(zhǎng)度約為2200?bp的條帶，與目的條帶大小一致（圖1）。將克隆結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，獲得的序列長(zhǎng)度為2178?bp，與轉(zhuǎn)錄組獲得的序列一致。

2.2 ?MiFY基因生物信息學(xué)分析

利用IBS 1.0軟件描述MiFY蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，MiFY由7個(gè)連續(xù)重復(fù)的WD40和2個(gè)PPLPP結(jié)構(gòu)域組成（圖2）。利用DNAMAN 8.0將MiFY與柑橘、橡膠樹(shù)等其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，其中，單下劃線為WD40結(jié)構(gòu)域，雙下劃線為PPLPP結(jié)構(gòu)域（圖3）。為了分析MiFY的親緣關(guān)系，使用DNAMAN 8.0的N-J方法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。結(jié)果顯示，芒果MiFY與柑橘CsFY1同源性最高，氨基酸相似性為86.48%，在進(jìn)化上和柑橘（CsFY）、蓖麻（RcFY）較為接近，同源性分別為86.07%、84.17%。由此可確定克隆所得基因?yàn)槊⒐鸉Y同源基因MiFY，GenBank登錄號(hào)為MT199952。

2.3 ?MiFY基因表達(dá)模式分析

為了探討MiFY基因在不同組織和不同成花時(shí)期的表達(dá)模式，在芒果成花不同發(fā)育時(shí)期，分別采集莖、葉和芽/花為材料進(jìn)行熒光定量檢測(cè)（圖5），結(jié)果表明，在‘四季蜜芒中，F(xiàn)Y基因在各個(gè)測(cè)試組織的各個(gè)時(shí)期均表達(dá)，但在芒果的成花誘導(dǎo)期之前表達(dá)水平偏低，而誘導(dǎo)期之后表達(dá)水平迅速上升，其中在成熟葉和芽中的上升水平高于成熟莖中的表達(dá)。MiFY基因的最高表達(dá)高峰出現(xiàn)在開(kāi)花期的成熟葉中，其次是在花芽分化期的頂芽中。在‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)芒中，MiFY基因模式與在‘四季蜜芒中的表達(dá)情況類似，均在成花誘導(dǎo)期之前表達(dá)水平很低，但其表達(dá)高峰主要出現(xiàn)在花芽分化后期和成花期，MiFY基因的最高表達(dá)高峰出現(xiàn)在花芽分化期的頂芽中，其次是在花芽分化期的成熟莖中，而在開(kāi)花期的花中也有很高的表達(dá)水平。在2個(gè)不同的品種中，MiFY基因的整體表達(dá)趨勢(shì)類似，但又存在著組織表達(dá)差異。

3 ?討論

近年來(lái)，借助擬南芥突變體，影響植物成花的很多基因被挖掘出來(lái)，植物成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究也越來(lái)越深入。與模式植物擬南芥相比，木本果樹(shù)具有較長(zhǎng)的童期，嚴(yán)重影響果樹(shù)的育種進(jìn)程，因此對(duì)果樹(shù)成花基因的挖掘與功能研究對(duì)縮短木本果樹(shù)的童期具有重要意義。FY基因作為自主途徑中調(diào)控植物成花的重要基因，其具有多重功能。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)Y基因的主要功能是正確定位成花抑制基因FLC的多腺苷化而控制開(kāi)花時(shí)間[9]。FY作為FLC的激活劑和抑制劑在調(diào)控開(kāi)花時(shí)間中具有雙重作用，可與FCA相互作用抑制FLC活性，也可通過(guò)激活FLC的表達(dá)而延遲開(kāi)花[16]。此外，F(xiàn)Y在種子休眠、ABA響應(yīng)、胚胎發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮作用[17-18]。最新研究結(jié)果表明，F(xiàn)Y在mRNA多腺苷化中具有保守性和特異性功能[19]。因此，研究和闡明FY基因在開(kāi)花途徑中的調(diào)控機(jī)理，對(duì)探索木本植物花期調(diào)控具有重要意義。

目前，F(xiàn)Y基因的功能研究?jī)H在少數(shù)單子葉植物（水稻、黑麥草、蝴蝶蘭）和雙子葉植物（擬單南芥）中[20-21， 23]，在木本植物中的調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。鑒于此，本研究在前期已完成芒果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，成功獲得1個(gè)FY同源基因，采用RT-PCR技術(shù)從‘四季蜜芒中克隆得到了MiFY的編碼區(qū)序列，對(duì)其氨基酸序列特性和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并分析MiFY在2個(gè)芒果品種中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，MiFY包含7個(gè)WD重復(fù)區(qū)域和2個(gè)PPLPP保守結(jié)構(gòu)域，與前人報(bào)道相同[20， 22]。其中，第一個(gè)PPLPP保守結(jié)構(gòu)域在C端區(qū)高度保守，與前人研究結(jié)果一致[7]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，芒果的MiFY與柑橘進(jìn)化關(guān)系最近，它們都屬于木本植物，這符合植物各科屬在進(jìn)化中的關(guān)系。黃玉婷[23]研究發(fā)現(xiàn)FY基因在蝴蝶蘭各個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá)，其中在第84天表達(dá)量最高，之后持續(xù)緩慢降低。本研究中MiFY基因在2個(gè)不同開(kāi)花習(xí)性芒果品種的所有測(cè)試組織中均表達(dá)，但存在組織表達(dá)差異，并且發(fā)現(xiàn)MiFY基因在2個(gè)芒果品種成花期均大量表達(dá)，而在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表達(dá)水平較低，這與在蝴蝶蘭中的結(jié)果類似。因此可以推測(cè)MiFY基因在不同芒果品種的成花過(guò)程均發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)芒果MiFY基因的克隆、序列分析和基因表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步深入研究MiFY基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰