利用PB設(shè)計(jì)篩選芽孢桿菌GUTU06產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶的主要影響因子

楊運(yùn) 何臘平 黃露 肖虹

摘 要：利用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)對芽孢桿菌GUTU06的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，旨在提高GUTU06所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力，并將其應(yīng)用于水解銀杏黃酮苷為苷元。結(jié)果表明蛋白胨和發(fā)酵時間為主要影響因子。在PB設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，獲得了初步優(yōu)化的培養(yǎng)條件，優(yōu)化后β-葡萄糖苷酶的酶活力為0.9914 U/g，較初始培養(yǎng)基提高了3.8倍。本文為β-葡萄糖苷酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時也為酶法水解銀杏黃酮苷的研究提供一定參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì); 主要因子; 芽孢桿菌; β-葡萄糖苷酶 ;銀杏黃酮苷

中圖分類號：TQ925

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）02-0080-04

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.014

Abstract：The main medium components and culture conditions of the solid fermentation medium of Bacillus sp.GUTU06 were screened by Plackett-Burman （PB） design to improve the enzyme activity of β-glucosidase，which is produced by GUTU06 and applied to hydrolyze ginkgo flavonoid glycosides into aglycones.The results of the experiment determined that peptone and fermentation time were the main influencing factors.On the basis of PB design，the initial optimized culture conditions were obtained.After optimization，the enzyme activity of β-glucosidase was 0.9914 U/g，which was 3.8 times higher than that of the initial medium.This paper lays a foundation for the industrial production of β-glucosidase，and also provides a reference for the study of enzymatic hydrolysis of ginkgo flavonoid glycosides.

Keywords：Plackett-Burman （PB） design; main factor;Bacillus;β-glucosidase; ginkgo flavonoid

銀杏葉（Ginkgo biloba L.）提取物是目前國際上使用較為廣泛的中草藥之一，主要藥效成分是黃酮類化合物[1]。銀杏黃酮占銀杏葉提取物總含量的22%～24%[2-3]，其主要由山奈酚、槲皮素以及異鼠李素等黃酮苷元與葡萄糖等單糖以O(shè)-糖苷鍵連接而成。黃酮類化合物在生物體內(nèi)代謝時，僅有占比很小的苷元型黃酮可以直接被腸道吸收進(jìn)入血液發(fā)揮作用，而占比很大的糖苷型黃酮則無法實(shí)現(xiàn)[4-6]。故水解銀杏黃酮為苷元極具現(xiàn)實(shí)意義[7]。

目前，水解銀杏黃酮主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法又細(xì)分為堿法和酸法，由于通過堿法所得的苷元不穩(wěn)定、易分解，故酸法較堿法應(yīng)用更為廣泛;生物法即酶法，其較酸法具有條件溫和、穩(wěn)定性好、活性成分保留完整等優(yōu)點(diǎn)，故酶法較酸法發(fā)展前景更加良好。水解酶的選擇范圍廣泛，因β-葡萄糖苷酶具有水解效果良好、測定方法簡便、應(yīng)用范圍普遍、理論研究清晰等特點(diǎn)[8-9]，故優(yōu)先選擇β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶來源廣泛，酵母菌[10]、霉菌[11]、腸道細(xì)菌[12]、芽孢桿菌[13]等均可產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室前期已從貴州傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的功能微生物芽孢桿菌GUTU06，此研究計(jì)劃通過PB設(shè)計(jì)篩選該菌主要培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步提高其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌GUTU06菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離，現(xiàn)已保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M 201923。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉5 g/L。

1.1.3 種子培養(yǎng)

從菌株GUTUO6活化斜面上挑取2環(huán)接種到250 mL錐形瓶中（含150 mL種子培養(yǎng)基），37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，制得種子液。

1.1.4 醋酸—醋酸鈉緩沖液配制

準(zhǔn)確吸取2.4 mL冰醋酸（冰乙酸）至燒杯，添加適量蒸餾水，再加入4.92 g無水醋酸鈉，溶解，定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至4.80±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。

1.1.5 1%銀杏黃酮苷溶液

準(zhǔn)確稱取1 g銀杏黃酮苷于燒杯中，加0.05 mol/L、pH 4.8醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解70 mL，待溶解完全后轉(zhuǎn)入容量瓶并繼續(xù)使用該緩沖液定容至100 mL，最后置于冰箱中備用。

1.1.6 黃豆前處理及黃豆固態(tài)發(fā)酵后粗酶液的制備

準(zhǔn)確稱量高質(zhì)量黃豆，加入8倍體積的去離子水，常溫浸泡18 h，瀝水后備用。稱50 g濕豆于250 mL三角瓶，添加一定量的碳源、氮源、無機(jī)鹽混勻，121 ℃滅菌20 min。冷卻后接種子液搖勻，37 ℃發(fā)酵，每12 h搖晃一次。培養(yǎng)結(jié)束后取出，于4 ℃冰箱后熟12 h即得豆豉。

稱取10 g后熟后的豆豉，加入20 mL的無菌生理鹽水中，4 ℃條件下浸提24 h，后用打漿機(jī)搗碎經(jīng)12000 r/min離心10 min，上清液即為固態(tài)發(fā)酵粗酶液。

1.1.7 β-葡萄糖苷酶活力的測定

以銀杏黃酮苷為底物，在測定條件下，將每分鐘水解銀杏黃酮苷產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位，用U/g表示。

測定原理：DNS試劑里的3，5-二硝基水楊酸分子中的硝基可被葡萄糖還原成3-胺基-5-硝基水楊酸（呈橙黃色）[14]。吸光值大小體現(xiàn)溶液橙黃色強(qiáng)度，溶液橙黃色強(qiáng)度展現(xiàn)葡萄糖量多少，而葡萄糖量表示酶活力高低，故可通過吸光值大小反映酶活力高低。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于具塞刻度試管中，補(bǔ)水至2 mL，加DNS試劑3 mL，混合后于沸水中煮10 min，冷卻后加水定容至15 mL，于波長540 nm處測吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]：y=0.4643x-0.0151，R2=0.9961。

酶活力測定方法：取15 mL具塞刻度試管加入底物（含銀杏黃酮苷溶液）1.8 mL，50 ℃預(yù)熱3 min，加入粗酶液0.2 mL，50 ℃水浴30 min，加入DNS試劑3 mL，沸水浴10 min，冷卻至室溫，定容至15 mL。以滅活的酶液為空白對照，于波長540 nm處測定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程計(jì)算粗酶液中葡萄糖質(zhì)量濃度[7]。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的 Plackett-Burman試驗(yàn)

在豆豉發(fā)酵的單因素預(yù)試驗(yàn)中，合適的碳源，氮源和無機(jī)鹽及接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度是果糖，糊精，蛋白胨，氯化鉀 ，接種量8%，發(fā)酵時間5 d，發(fā)酵溫度34 ℃對β-葡萄糖苷酶的酶活有明顯的正面影響。因此，它們被選為PB設(shè)計(jì)的媒介組合。對于PB設(shè)計(jì)，在兩個級別（級別+1和級別-1，如表1所示）中評估七個變量和四個虛擬變量。根據(jù)PB設(shè)計(jì)，表1中顯示了培養(yǎng)基的成分濃度，此階段試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立由Design-Expert軟件8.06（Stat-Ease，Inc.，Minneapolis，USA）進(jìn)行[15]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測定至少3次，取其平均值，通過Design-Expert 8.06和SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來優(yōu)化培養(yǎng)基是研究幾種因素的影響和提高產(chǎn)量的有效方法。PB統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)是兩級因子設(shè)計(jì)的一部分，允許用至少“n”個試驗(yàn)[11]研究“n-1”變量，這對于發(fā)現(xiàn)影響因素的重要性非常有用[16]。

因此，以果糖、糊精、蛋白胨、氯化鉀、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為考查對象，按照Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行了12次試驗(yàn)（表 2）。表2結(jié)果的方差分析如表3所示。

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析表明，蛋白胨（X2）、發(fā)酵時間（X8）對β-葡萄糖苷酶酶活有顯著影響（P<0.05），其他5個因素的影響不顯著（P>0.05）不進(jìn)入模型。此模型P<0.05，說明合適。因此，在忽略了不重要的條件（P>0.05）后，用一個修正的一階方程用編碼因子描述了β-葡萄糖苷酶酶活，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到的模型方程為 ：

Y=0.733+0.074X2+0.07X8（1）

（1）式表明蛋白胨濃度和發(fā)酵時間對β-葡萄糖苷酶酶活有影響，即高濃度的蛋白胨可以提高β-葡萄糖苷酶酶活。這可能是由于蛋白胨中含有促進(jìn)產(chǎn)酶的營養(yǎng)成分;同時，較長的發(fā)酵時間也能提高β-葡萄糖苷酶酶活。同時根據(jù)（1）式可得，經(jīng)優(yōu)化后β-葡萄糖苷酶酶活的理論值可以達(dá)到0.87 U/g。

根據(jù)他和PB設(shè)計(jì)，優(yōu)化培養(yǎng)基應(yīng)有：X2、X8取高水平，其他因素水平取低水平，用優(yōu)化的培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)，做6組平行試驗(yàn)。結(jié)果如表4所示。

所得β-葡萄糖苷酶酶活為0.9914 U/g（表4），高于預(yù)測值0.87 U/g。基本符合預(yù)測的優(yōu)化結(jié)果。表明PB設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果是可信的，根據(jù)前期試驗(yàn)已知基礎(chǔ)培養(yǎng)基酶活為：0.2601 U/g。因此，通過PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，β-葡萄糖苷酶的酶活提高了3.8倍。

PB試驗(yàn)結(jié)果也表明PB試驗(yàn)是尋找影響微生物培養(yǎng)的主要影響因素的有效手段。陳志杰等[17]也利用PB 設(shè)計(jì)在靈芝生長及產(chǎn)胞外多糖主要影響因子為蔗糖 、磷酸二氫鉀、和硫酸鋅;李翠琴等[15]通過PB設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)影響黑曲霉GZUF36產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)的主要因子為葡萄糖，豆餅粉和氯化鉀，通過PB設(shè)計(jì)其產(chǎn)脂肪酶活力提高了0.78倍。本試驗(yàn)也取得了良好結(jié)果，為后續(xù)的進(jìn)一步如何提高解淀粉芽孢桿菌GUTU06產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的β-葡萄糖苷酶的酶活力試驗(yàn)指明了方向和奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過PB設(shè)計(jì)尋找影響產(chǎn)水解銀杏黃酮苷的新菌株解淀粉芽孢桿菌GUTU06的產(chǎn)酶培養(yǎng)的主要因素，以提高其β-葡萄糖苷酶的活力。評價指標(biāo)是β-葡萄糖苷酶水解銀杏黃酮苷的能力。研究了4種培養(yǎng)基成分和3種培養(yǎng)條件的作用，發(fā)現(xiàn)蛋白胨和發(fā)酵時間是影響解淀粉芽孢桿菌GUTU06β-葡萄糖苷酶的活力的重要因素。在此基礎(chǔ)上獲得了初步優(yōu)化的培養(yǎng)條件，其中提高后β-葡萄糖苷酶的活力為0.9914 U/g。與使用初始培養(yǎng)基相比，β-葡萄糖苷酶的活力增加了3.8倍。該研究為使用響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化β-葡萄糖苷酶和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用此酶水解銀杏黃酮苷制備銀杏黃酮苷元奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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