煙草莖點病菌生物學特性及室內(nèi)毒力測定

商勝華 江艷 桑維鈞 張開虹 楊茂發(fā)

摘 要：為明確煙草莖點病菌廣生莖點霉Phoma omnivirens的最佳培養(yǎng)條件并篩選出有效的防治藥劑，為生產(chǎn)實踐中防治煙草莖點病提供理論依據(jù)。以病原菌P.omnivirens為試材，采用菌絲生長速率法，研究了病原菌P.omnivirens的生物學特性，并測定了12種供試殺菌劑對病原菌的抑制效果。病原菌P.omnivirens的最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基;菌絲在5～30 ℃范圍內(nèi)均可生長，最適溫度為30 ℃，5 ℃時菌絲生長最慢;PDA培養(yǎng)基pH為10時菌絲生長最快;光照對菌絲生長無顯著影響;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣;菌絲的致死溫度為58 ℃ 10 min。12種殺菌劑中，3%中生菌素WP具有最佳抑菌效果，EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是EC50為2.6940 mg/L的0.3%梧寧霉素AS和EC50為2.7917 mg/L的80%代森錳鋅WP。生產(chǎn)上可將這3種藥劑作為防治煙草莖點病的備選藥劑。

關(guān)鍵詞：煙草莖點病;廣生莖點霉;生物學特性;毒力測定

中圖分類號：S432.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）02-0001-08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.001

Abstract：In order to provide theoretical basis for prevention and control of tobacco black spot stalk，this study explored the biological characteristics of Phoma omnivirens and tested its virulence determination.The biological characteristics of P.omnivirens was analyzed by hypha growth rate method，and the effect of twelve fungicides on the pathogen were also determined.The results showed that Nutrient Agar（NA），Oatmeal Agar（OMA） and Potato Dextrose Agar（PDA） were the most suitable culture medium for the growth of P.omnivirens.The mycelium could grow in the temperatures ranging from 5 ℃ to 30 ℃，30 ℃ was the optimum temperature for mycelium growth，and the mycelium grew the slowest at 5 ℃.The mycelium grew fastest at pH 10 in PDA.Different light conditions did not significantly influence the growth of mycelium.The optimal carbon source for the medium were sucrose，and the best nitrogen sources were potassium nitrate and calcium nitrate，respectively.The lethal temperatures of mycelium was 58 ℃ for 10 min.Among the 12 fungicides，3% Zhongshengmycin had the best inhibitory effect with the lowest EC50 of 0.9419 mg/L;followed by 0.3% Tetramycin and 80% Mancozeb，with EC50 of 2.6940 mg/L and 2.7917 mg/L，respectively.These three fungicides can be used to control tobacco black spot stalk in the field.

Keywords：tobacco black spot stalk;Phoma omnivirens;biological characteristics;virulence determination

17世紀初葉，煙草開始傳入我國[1-2]，成為我國重要的經(jīng)濟作物之一，在我國的經(jīng)濟發(fā)展上起到了極大的促進作用。但煙草病害的發(fā)生制約了煙葉產(chǎn)量的提高，使煙農(nóng)收入受到嚴重影響。截止2002年，已報道116種煙草病害，其中79種為侵染性病害，37種為非侵染性病害[3-4]。煙草莖點病是一種偶發(fā)性的真菌性病害，可危害黃花煙和普通煙，田間大多于成株期危害煙株莖基部，使養(yǎng)分和水分的疏導(dǎo)受阻，葉片早衰，嚴重時莖稈和葉片枯死，造成煙葉產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低[5]。研究煙草莖點病菌的生物學特性、篩選高效抑制病原菌生長的殺菌劑對了解煙草莖點病的發(fā)生規(guī)律和生產(chǎn)上有效防治該病害具有重要意義。于莉等[6]最早在吉林省發(fā)現(xiàn)煙草莖點病，并將煙草莖點病病原鑒定為半知菌亞門Deuteromycotina，球殼孢目Sphaeropsidales，球殼孢科Sphaeropsidaceae，莖點霉屬Phoma，Phoma tabaci Em.Sousa da Camara。此后，該病害也僅在吉林[7-8]、陜西[9]和河南[10]三省有過報道，但均未開展深入研究。直至2018年，江艷等[11]在貴州省再次發(fā)現(xiàn)了煙草莖點病，并根據(jù)形態(tài)學特征和分子生物學技術(shù)將病原菌鑒定為廣生莖點霉Phoma omnivirens，致病性測定結(jié)果表明該病原菌可侵染煙株的葉片和莖稈。目前，還未見關(guān)于煙草莖點病病原菌生物學特性研究和防治該病害的相關(guān)報道。鑒于此，本研究采用菌絲生長速率法對煙草莖點病菌P.omnivirens的生物學特性及室內(nèi)毒力測定進行研究。以期能明確最適宜P.omnivirens生長的條件，同時篩選出高效抑制其生長的殺菌劑，為田間防治該病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：研究所用菌株為廣生莖點霉P.omnivirens，采集于貴州省貴安新區(qū)具有典型發(fā)病癥狀的煙草莖點病病株，經(jīng)分離、鑒定及致病性測定的病原菌菌株，現(xiàn)保存于貴州大學農(nóng)學院植物病理教研室，菌株編號為HGUP8001。

供試藥劑：3%中生菌素WP，福建凱立生物制品有限公司;0.3%梧寧霉素AS，遼寧微科生物工程股份有限公司;80%代森錳鋅WP，四川國光農(nóng)業(yè)股份有限公司;20%苯醚甲環(huán)唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;40%丙環(huán)唑ME，青島瀚生生物科技股份有限公司;70%甲基硫菌靈WP，江蘇龍燈化學有限公司;50%福美雙WP，河北贊峰生物工程有限公司;12.5%腈菌唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;8%寧南霉素AS，德強生物股份有限公司;80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司;8×108個/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP，山東泰諾藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的生物學特性研究

培養(yǎng)基對菌絲生長的影響：參照方中達[12]的方法配置以下培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、查氏培養(yǎng)基（Czapek）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CDA）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA），pH為配制培養(yǎng)基時的自然值。供試菌株接于PDA平板， 25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)5 d，用打孔器沿菌落邊緣打孔，取打下的菌餅接于供試培養(yǎng)基平板中央，菌絲面朝下，每處理3個重復(fù)，置于25 ℃黑暗恒溫的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落情況，5 d后測量菌落直徑。該研究中接種的所有菌餅打取方法及接種方法如上，培養(yǎng)皿直徑均為90 mm，菌落直徑均使用十字交叉法測量。

溫度對菌絲生長的影響：將5 mm菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，每日觀察，5 d后測量菌落直徑，培養(yǎng)基pH為配制時的自然值。

pH值對菌絲生長的影響：用1 mol/L的稀鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4、5、6、7、8、9、10、11，平板中央接入直徑5 mm的菌餅，每處理3個重復(fù)，25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

光照條件對菌絲生長的影響：在PDA平板上接入直徑5 mm的菌餅，培養(yǎng)基pH為配制時的自然值，分別置不同光照（連續(xù)光照、24 h光暗交替和連續(xù)黑暗）條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

菌絲致死溫度：在每支試管中裝入5 mL無菌水，并接入3個直徑為5 mm的菌餅，分別置于40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中恒溫水浴10 min，取出流水冷卻，將各處理的菌餅接于PDA平板，培養(yǎng)基pH為配制時的自然值，每平板1個菌餅，置于25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后根據(jù)各處理能否長出菌絲確定致死區(qū)間，能長出菌絲的最高溫度為致死區(qū)間下限，無菌絲長出的最低溫度為致死區(qū)間上限;區(qū)間內(nèi)以1 ℃為一個梯度，每溫度為一個處理，根據(jù)各處理能否長出菌絲確定致死溫度，即不長菌絲的最低溫度為菌絲致死溫度。

碳、氮源對菌絲生長的影響：以等量的麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、淀粉、果糖、肌醇代替查氏培養(yǎng)基中的蔗糖，同時蔗糖為碳源作為對照;以等量L-苯丙氨酸、氨基乙酸、草酸銨、L-精氨酸、L-谷氨酸、硝酸鉀、硝酸鈣、硫酸銨代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，硝酸鈉為氮源作為對照，制成不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板，接入直徑5 mm的菌餅，培養(yǎng)基pH均為配制時的自然值，25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

1.2.2 室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法[13]，測定各供試殺菌劑對病原菌P.omnivirens的抑制作用，供試藥劑劑型及生產(chǎn)廠家見1.1。參照高亞星等[14]配制不同濃度梯度農(nóng)藥的方法，將供試藥劑用無菌水配制成各藥劑所需的濃度梯度的10倍，然后按9∶1 的比例將PDA培養(yǎng)基與所配藥劑混合，制成各濃度梯度的含藥平板，以加等量無菌水的培養(yǎng)基平板為對照，每處理3個重復(fù)，各平板接入直徑為5 mm的菌餅，25 ℃黑暗條件恒溫培養(yǎng)，每日觀察，7 d后十字交叉法測量菌落直徑，并根據(jù)抑制率公式[15]計算各處理抑制率。

抑制率（%）=[（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

研究數(shù)據(jù)用Excel 2016進行統(tǒng)計和生長速率計算，采用DPS 7.05的Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析，采用Graphpad prism 7.0繪制柱形圖，用農(nóng)藥室內(nèi)試驗數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件[16]計算毒力回歸方程Y=A+B*X，抑制中濃度EC50和相關(guān)系數(shù) R，X為藥劑濃度的對數(shù)值，Y為菌絲體抑制百分率的機率值。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的生物學特性

2.1.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

煙草莖點病菌在不同培養(yǎng)基中的生長速率如圖1所示，在供試的7種培養(yǎng)基上均能生長，最利于煙草莖點病菌生長的培養(yǎng)基是PDA、OMA和NA，菌絲生長最快，與其他培養(yǎng)基上的菌絲生長速率差異顯著，其次是CMA、Czapek、CDA，而在MEA培養(yǎng)基上生長最慢，生長速率最小。

2.1.2 溫度對菌絲生長的影響

如圖2所示，P.omnivirens在5～30 ℃條件下均能生長，且隨著溫度的升高生長越快，各處理的菌絲生長速率差異顯著。5 ℃時菌絲生長緩慢，僅長出少許稀薄的菌絲，30 ℃時菌絲生長最快且濃密，35 ℃及以上溫度時菌絲停止生長。

2.1.3 pH對菌絲生長的影響

如圖3所示，P.omnivirens對pH有較強的適應(yīng)性，在pH 4～11范圍內(nèi)均可生長，在pH 4～10范圍內(nèi)生長速率呈上升趨勢，pH 5～9之間各處理菌絲生長速率差異不顯著，pH達到11時其生長速率減慢，由此可知P.omnivirens既能適應(yīng)酸性環(huán)境，也能適應(yīng)堿性環(huán)境，最適生長pH為10。

2.1.4 光照對菌絲生長的影響

由圖4可以看出，P.omnivirens菌絲在3種光照條件（連續(xù)光照、24 h光暗交替和連續(xù)黑暗）下生長速率差異不顯著，說明光照條件的變化對P.omnivirens菌絲的生長速率影響不顯著，但菌絲顏色會隨著黑暗時間的增長而加深。

2.1.5 菌絲的致死溫度

P.omnivirens在各預(yù)設(shè)溫度條件下水浴10 min后，小于等于55 ℃時菌絲均可生長，大于等于60 ℃時菌絲不生長，說明菌絲的致死區(qū)間為55～60 ℃;再此區(qū)間內(nèi)進一步的試驗結(jié)果顯示，58 ℃及以上溫度水浴10 min后菌絲均不生長，說明菌絲的致死溫度為58 ℃ 10min。

2.1.6 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

研究結(jié)果表明，7種碳源對菌絲生長速率的影響存在差異（圖5），以蔗糖為碳源的查氏培養(yǎng)基菌絲生長最快，肌醇為碳源時，菌絲生長最慢，因此，蔗糖為最佳碳源。由圖6可知，P.omnivirens在9種氮源的查氏培養(yǎng)基中生長速率差異顯著，以硝酸鉀和硝酸鈣為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長最快，其次是L-精氨酸和硝酸鈉，以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長最慢，因此硝酸鉀和硝酸鈣為最佳氮源。

2.2 室內(nèi)毒力測定

研究結(jié)果表明（表1），12種殺菌劑在對應(yīng)的濃度梯度范圍內(nèi)均對煙草莖點病菌有較好的抑菌作用，且抑制率與供試藥劑濃度呈正相關(guān)。80%代森錳鋅WP和50%福美雙WP在使用濃度分別為16 mg/L和500 mg/L時抑制率均大于90%。3%中生菌素WP、0.3%梧寧霉素AS和20%苯醚甲環(huán)唑EW隨濃度的增加抑制率均達85.97%～89.03%，其余藥劑隨濃度的增加抑制率也在63.5%～79.5%之間。

12種殺菌劑中，3%中生菌素WP的EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP，EC50值分別為2.6940 mg/L和2.7917 mg/L。40%丙環(huán)唑ME和20%苯醚甲環(huán)唑EW的EC50值也小于20 mg/L。抑制中濃度EC50是殺菌劑毒力的可靠標準，EC50越小，說明其抑菌效果越好[17]。因此，在12種殺菌劑中，3%中生菌素WP對煙草病菌的抑制效果最好，0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP次之。

3 結(jié)論與討論

病原菌的生物學特性是監(jiān)控病害發(fā)生的前提條件[18-19]，但目前未見P.omnivirens的生物學特性研究的相關(guān)報道。本研究結(jié)果表明，煙草莖點病菌P.omnivirens對不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳氮源具有不同程度的適應(yīng)性，對不同光照條件的選擇無顯著差異;最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基，3種培養(yǎng)基中，以馬鈴薯培養(yǎng)基配制最為簡單、廉價，且在微生物相關(guān)研究中使用頻率高，因此本文其他部分的研究均使用該培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基;最適生長溫度為30 ℃，35 ℃及以上時，菌絲停止生長，這與李海洋等[20]對同屬P.dictamnicol生物學特性的研究結(jié)果一致，說明該菌在高溫條件下不易存活，這或許是煙草莖點病目前尚未大面積發(fā)生的原因之一;菌絲在pH為4～11之間均可生長，pH為10時菌絲生長速率最大;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣，菌絲致死溫度為58 ℃ 10 min;不同光照條件下菌絲的生長速率無顯著差異。

Phoma是一個廣泛分布的屬，在該屬已報道的3000種中有110種為病原菌，常引起植物葉片枯萎、根部腐爛甚至整株植株萎蔫[21]。本研究對煙草莖點病菌P.omnivirens的生物學特性的研究結(jié)果不僅有助于了解煙草莖點病的發(fā)生和病害循環(huán)，為防治該病害奠定基礎(chǔ)，也可為P.omnivirens引起的其他病害及同屬病原菌的相關(guān)研究提供參考。

目前，生產(chǎn)上的農(nóng)作物病蟲害防治主要還是依靠化學農(nóng)藥，但隨著人們對環(huán)境和食品安全要求的提高，生物農(nóng)藥也逐漸得到關(guān)注。本文采用菌絲生長速率法測定 12 種殺菌劑（7種化學殺菌劑和5種生物農(nóng)藥）對煙草莖點病菌P.omnivirens的室內(nèi)毒力，結(jié)果顯示生物農(nóng)藥3%中生菌素WP和0.3%梧寧霉素AS對菌絲的抑制效果最好，EC50分別為0.9419 mg/L和2.6940 mg/L，生產(chǎn)上也將這兩種生物農(nóng)藥用于防治其他病害[22-23]，可將其作為田間防治煙草莖點病的選用藥劑。同時，化學殺菌劑50%代森錳鋅WP也對煙草莖點病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，其EC50為2.7917 mg/L，也可作為生產(chǎn)上防治煙草莖點病的備選藥劑。但該研究選用的殺菌劑僅在室內(nèi)進行試驗，具有一定的局限性。田間防治效果還與病原菌的孢子[24]、殺菌劑的特性[25]以及寄主植物的生長環(huán)境等[26]有關(guān)，后續(xù)還需進一步的田間防治試驗進行驗證。另外，針對不同地區(qū)的煙草莖點病，其病原菌菌株不同，生物學特性和防治藥劑是否一樣還需進一步探究。

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