高密度懸浮轉染方式高效獲得重組桿狀病毒

尹坤，王同燕，宋歡歡，白露露，李勝強，譚菲菲，田克恭,3*

(1. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471003；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471003；3. 洛陽普泰生物技術有限公司，河南 洛陽 471003)

桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system, BEVS)是近年來被廣泛用于高效表達外源蛋白的載體系統(tǒng)，為重組蛋白單體、多聚體蛋白復合物、病毒樣顆粒、膜蛋白以及對哺乳動物細胞有毒的蛋白提供了通用的表達平臺，廣泛應用于醫(yī)學、農學和獸醫(yī)學等各個領域[1]。相對于原核、酵母和CHO等表達系統(tǒng)，BEVS具有一定優(yōu)勢：桿狀病毒專一寄生于無脊椎動物，安全性高；可對重組蛋白進行正確折疊和翻譯后修飾，獲得具有生物活性的蛋白；適應于多基因表達如病毒樣顆粒 (virus-like particle) 的復雜設計；適用于大規(guī)模無血清培養(yǎng)等[2-6]。在實際生產過程中，貼壁轉染獲得的P0代重組病毒滴度低，需要進一步病毒擴繁來獲得高滴度的重組病毒，但由于重組桿狀病毒在傳代過程中基因組存在不穩(wěn)定性，在重組病毒擴繁中會導致目的基因片段的丟失，成為重組桿狀病毒產品產業(yè)化過程中的限制因素之一[7-8]。將傳統(tǒng)貼壁轉染方式獲得的P0代重組病毒傳代放大，使重組病毒滴度與外源蛋白表達均達到最優(yōu)，此過程需要12～20 d傳代周期[9]。

本研究利用ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent和ExpiSf9對重組Bacmid進行高密度懸浮轉染，可在6～10 d內獲得足量、高病毒滴度和高表達量的低代次重組桿狀病毒，為利用重組桿狀病毒表達外源蛋白的產業(yè)化生產提供了一條可行的路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ExpiSf9細胞、Sf-900TMⅡ SFM、Opti-MEM、DAB Kit、ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent、CellfectinTMⅡ Reagent、HRP標記羊抗鼠IgG均購自于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NC膜購自上海生工；細胞板、細胞瓶購自康寧公司；臺盼藍細胞染色液購自于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；表達豬細小病毒VP2蛋白的重組Bacmid、Sf9細胞和豬細小病毒多克隆抗體由國家獸用藥品工程技術研究中心制備并保存。

1.2 表達豬細小病毒VP2重組桿狀病毒拯救

1.2.1 懸浮轉染

將懸浮Expisf9細胞稀釋至密度為2.50×106個/mL，置于27～28 ℃振蕩培養(yǎng)箱備用；取120 μL ExpiFectaminTMSf Transfection Reagent加入到1 mL opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，顛倒混勻10 次，室溫靜置5 min，然后加入50 μg含有豬細小病毒 VP2基因的重組 Bacmid，輕柔混勻10次，室溫孵育5 min后，將混合液加入到100 mL 準備好的Expisf9細胞中，在27～28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)；轉染后24、48、72、96和120 h，分別取懸浮細胞100 μL，與0.4%的臺盼藍等體積混勻，使用細胞計數(shù)儀進行細胞密度和細胞活率的監(jiān)測，待懸浮轉染細胞活率降至70%～80%時，收獲重組桿狀病毒，并記為P0代。

1.2.2 貼壁轉染

6孔板中每孔接種Sf9細胞0.9×106～1×106個，室溫靜置30 min～1 h；取8 μL CellfectinTMⅡ Reagent 加入到100 μL Sf-900TMⅡ SFM中并充分混勻，取3 μg含有豬細小病毒 VP2基因的重組Bacmid加入到另一管100 μL Sf-900 Ⅱ SFM培養(yǎng)基中并充分混勻；將上述兩管合并混勻，置于室溫靜置孵育15～30 min；孵育結束后將混合液輕柔加入到細胞培養(yǎng)液中，置于27～28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，轉染3～5 h后換為含有10%血清的昆蟲細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)放入27 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；轉染后每天觀察細胞狀態(tài)，待細胞出現(xiàn)明顯病變時收獲P0代重組桿狀病毒。

1.3 重組桿狀病毒P0代滴度測定

將兩種轉染方式收獲的P0代重組桿狀病毒10倍梯度稀釋后，分別接種于鋪有Sf9細胞的96孔板，每孔6.5×104個細胞，27 ℃培養(yǎng)箱吸附1 h后，換為甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)43～48 h，吸棄半固體培養(yǎng)基，80%丙酮固定細胞后加入桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體，孵育1 h后洗3 次，然后加入HRP標記的羊抗鼠二抗孵育1 h，最后通過底物顯色，在顯微鏡下對出現(xiàn)藍色斑點的數(shù)量進行統(tǒng)計，計算不同轉染方式獲得的P0代重組桿狀病毒滴度(PFU/mL)。

1.4 P0代重組桿狀病毒的蛋白表達鑒定

將不同轉染方式獲得的P0代重組桿狀病毒培養(yǎng)物進行超聲破碎4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清進行SDS-PAGE、Western blot等鑒定。SDS-PAGE和Western blot的具體步驟為：制備電泳樣品進行SDS-PAGE，同時將蛋白轉印至NC膜上，以鼠源豬細小病毒多抗血清按照 1∶1 000稀釋后作為一抗，37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗滌后，使用HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗，孵育1 h，使用DAB顯色試劑盒避光顯色2 min，終止顯色后分析蛋白的反應性。

1.5 重組桿狀病毒傳代及HA效價測定

將收獲的P0代重組桿狀病毒以體積比1∶100接種Sf9細胞，接種72 h待細胞病變明顯時，收獲上清即為P1代重組桿狀病毒毒種，按照此方法依此獲得P2～P5代重組桿狀病毒，對P0～P5代重組桿狀病毒表達豬細小病毒VP2的HA效價進行測定。

HA效價測定具體方法為：在96孔V型微量反應板每孔均加25 μL PBS，吸取25 μL離心，上清加入第1孔混勻；從第1孔吸取25 μL混合液加入第2孔混勻，依次倍比稀釋，最后一孔不加抗原作為空白對照，每孔加入25 μL 0.5%豚鼠紅細胞懸液，輕輕震蕩均勻，室溫靜置1 h后觀察結果。在空白對照成立的條件下，以出現(xiàn)100%凝集的最高稀釋倍數(shù)為HA效價。

2 結果

2.1 不同轉染方式對細胞增殖及細胞活率的影響

提取的PPV VP2 Bacmid分別進行貼壁轉染Sf9或高密度懸浮轉染ExpiSf9細胞，使用細胞計數(shù)儀對細胞數(shù)和細胞活率進行統(tǒng)計，結果如圖1和圖2所示。轉染后第3天ExpiSf9細胞密度由初始的2.50×106個/mL增加至6.53×106個/mL，并在轉染后第4天達到至7.47×106個/mL，且細胞活率都保持在95% 以上。在轉染后第3天，Sf9細胞的細胞密度增加到0.95×106個/mL，細胞活率同樣保持在95%以上，但轉染第4天后細胞密度下降至0.76×106個/mL，活率也下降至89.2%。通過對比不同轉染方式后細胞密度和活率變化，結果表明，無論使用Cellfectin Ⅱ Reagent 對Sf9細胞進行貼壁轉染，還是ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent對ExpiSf 9進行懸浮轉染后細胞數(shù)量依然在進行生長，表明轉染試劑并沒有對細胞增殖造成傷害。

圖1 懸浮或貼壁轉染對細胞密度的影響

圖2 不同轉染方式細胞活率變化

2.2 不同轉染方式對P0代重組桿狀病毒滴度的影響

對貼壁轉染Sf9和高密度懸浮轉染ExpiSf9獲得的P0代重組病毒進行病毒滴度測定，使用針對桿狀病毒gp64抗體作為一抗，測定結果如圖3所示。貼壁轉染方式P0代病毒滴度為1.8×107PFU/mL，而懸浮轉染ExpiSf9 獲得的P0代病毒滴度為1.2×108PFU/mL，高密度懸浮轉染方式獲得的P0代重組桿狀病毒滴度要明顯高于貼壁轉染方式。

圖3 不同轉染方式獲得的P0重組病毒滴度

2.3 不同轉染方式對P0代重組桿狀病毒蛋白表達量的影響

對不同轉染方式收獲的P0代重組桿狀病毒進行VP2蛋白表達鑒定，通過SDS-PAGE和Western blot分別檢測外源蛋白的表達情況。SDS-PAGE鑒定表明不同轉染方式獲得的重組桿狀病毒均有條帶，大小與預期蛋白大小(65 kDa)一致。高密度懸浮轉染獲得的P0代重組桿狀病毒所表達的VP2蛋白量要高于貼壁轉染所獲得的重組蛋白量(圖4)。Western blot鑒定結果如圖5所示，兩種P0代重組桿狀病毒表達的豬細小病毒VP2蛋白均能夠與鼠源豬細小病毒多抗血清反應，表明重組PPV VP2蛋白具有良好反應原性。

M.蛋白分子標準質量；1.Sf9細胞對照；2.貼壁轉染獲得的PPV VP2蛋白；3.高密度懸浮轉染獲得的PPV VP2蛋白

M.蛋白分子標準質量；1.Sf9細胞對照；2.貼壁轉染獲得的PPV VP2蛋白；3.高密度懸浮轉染獲得的PPV VP2蛋白

2.4 不同轉染方式對不同代次病毒外源蛋白HA效價的影響

對收獲的貼壁轉染和高密度懸浮轉染獲得的P0代重組桿狀病毒，分別傳代至P5代，測定P0～P5代重組桿狀病毒表達PPV VP2的HA效價。不同代次重組PPV VP2 蛋白的HA效價變化如圖6所示。相對于貼壁轉染方式，懸浮轉染獲得的P0代和P1代重組病毒，所表達的重組PPV VP2、HA效價提高極顯著(P<0.01)獲得的P0代重組病毒，高密度懸浮轉染獲得的P0代重組病毒接種Sf9細胞表達的重組PPV VP2蛋白的HA效價提高8倍，且高密度懸浮轉染獲得重組病毒通過傳代獲得的P1～P5代表達的重組PPV VP2 HA效價均較高，P1代就能達到19 log2，而貼壁轉染方式獲得的重組病毒需要傳至P3代時才能達到此水平。

**差異極顯著，P<0.01

3 討論

桿狀病毒表達系統(tǒng)具有外源基因容量大、翻譯后修飾功能、生物安全性好、體外培養(yǎng)簡單等特點，被廣泛地應用于不同物種來源的重組蛋白的表達[10-11]。目前使用昆蟲細胞體外培養(yǎng)是獲得大量重組桿狀病毒簡便有效的方法，常采用重組Bacmid貼壁轉染Sf9細胞以獲得重組桿狀病毒，但由于貼壁Sf9細胞數(shù)量有限，且獲得的P0代重組桿狀病毒體積較小病毒滴度較低，需要多次傳代才能到達所需的體積和病毒滴度，然而，重組桿狀病毒在連續(xù)生產或按比例擴繁過程中會形成和積累DI(defective interfering particle，DI)顆粒，這些不能自主復制的缺陷干擾顆粒的基因組比例缺失高達40%[12-14]。隨著缺陷型重組桿狀病毒在搖瓶培養(yǎng)/或生物反應器中的連續(xù)傳代，占比逐漸增加，結果導致外源蛋白產量下降[7,15]。因此，采用傳統(tǒng)的轉染方法，對于實驗室進行蛋白表達可能不受影響，但對于重組桿狀病毒產品的產業(yè)化仍然存在問題。

為了減少由于DI顆粒的產生導致外源蛋白表達量降低的影響，近些年來科學家們不斷對載體進行基因改造以期望獲得更加穩(wěn)定的桿狀病毒載體，同時也在不斷的進行培養(yǎng)基改良，生物反應器的使用以及工藝方面的優(yōu)化等多方面的努力，為后續(xù)產業(yè)化生產奠定理論和實踐基礎。我們在實際生產過程也嘗試多種優(yōu)化方案，其中包括高密度懸浮轉染，這種轉染方式獲得的低代次高滴度的重組桿狀病毒，便于在后續(xù)使用過程中以低感染復數(shù)進行感染，可以減少傳代效應對外源蛋白表達量的影響。在當前無法完全克服由于傳代產生DI顆粒，并導致外源蛋白表達量大幅度降低的條件下，選擇高密度懸浮轉染在低代次提供足量種子批，為后續(xù)生產提供保障，為產業(yè)化生產提供了一條可行的路徑。