外周血胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)診斷染色體異常及假陽(yáng)性原因分析

陳玫君 田艷紅 郭飛波

湖北省天門(mén)市第一人民醫(yī)院(431700)

在新生兒出生缺陷中染色體異常是最常見(jiàn)病因，產(chǎn)前檢查常采用超聲影像學(xué)篩查及血清學(xué)檢測(cè)評(píng)估胎兒出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)，但存在檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性不高等缺點(diǎn)[1]。介入性羊水染色體核型分析產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性達(dá)98%～99%，成為胎兒染色體異常及出生缺陷診斷金標(biāo)準(zhǔn)[2]。但羊水穿刺可增加宮內(nèi)感染、羊水滲漏、流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，且不適用于所有孕婦。1997年LO[3]開(kāi)創(chuàng)了利用孕婦外周血胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)。目前NIPT已廣泛用于產(chǎn)前21-三體、18-三體、13-三體、性染色體等染色體異常檢測(cè)，檢測(cè)敏感性與特異性顯著提升。然而大量臨床實(shí)踐[4]，NIPT假陽(yáng)性時(shí)有發(fā)生，與羊水穿刺核型檢測(cè)相比假陽(yáng)性發(fā)生率為0.1%～0.3%，限制了NIPT廣泛應(yīng)用。目前針對(duì)NIPT檢測(cè)染色體異常的研究較多，但鮮有關(guān)于探究NIPT假陽(yáng)性的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究分析了NIPT診斷染色體異常的應(yīng)用價(jià)值，重點(diǎn)分析NIPT假陽(yáng)性緣由，為提高NIPT臨床應(yīng)用提供參考與借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月—2019年12月于本院行NIPT的單活胎孕婦10236例臨床資料，年齡(28.7±8.5)歲(19～47)歲，孕周(19.6±5.4)周(11～23)周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)B超檢查確定孕周11～23周；②單胎妊娠；③知情同意且自愿行NIPT檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①染色體異常；②接受過(guò)移植手術(shù)、干細(xì)胞治療或短期輸注異體血液制品、免疫治療等。NIPT檢測(cè)陽(yáng)性孕婦，根據(jù)本人及家屬意愿行羊膜腔穿刺胎兒染色體核型分析。對(duì)NIPT假陽(yáng)性且孕婦自愿繼續(xù)妊娠分娩者行NIPT假陽(yáng)性原因分析。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 檢測(cè)方法及評(píng)估

采集孕婦空腹外周靜脈血漿， 4℃恒溫離心處理后取上層血漿，采用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取胎兒游離DNA。采用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(中國(guó)博奧公司)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，采用高通量基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行樣本測(cè)序檢測(cè)。計(jì)算每條染色體reads所占比例及Z值，評(píng)估染色體非整倍體異常情況。對(duì)NIPT檢測(cè)提示高風(fēng)險(xiǎn)者，向孕婦及家屬進(jìn)行遺傳咨詢與羊膜腔穿刺胎兒染色體核型分析建議，并告知侵入性產(chǎn)前診斷風(fēng)險(xiǎn)，簽署知情同意書(shū)。B超引導(dǎo)下經(jīng)孕婦腹羊膜腔穿刺取羊水20ml，常規(guī)處理后，采用ISCN2016計(jì)數(shù)與核型分析，提示NIPT假陽(yáng)性且孕婦自愿繼續(xù)妊娠并分娩者，于孕婦分娩后采集孕婦靜脈血，按NIPT檢測(cè)方法對(duì)樣本進(jìn)行處理與高通量DNA測(cè)序檢測(cè)。采集胎盤(pán)組織樣本，生理鹽水清洗母血經(jīng)處理后采用高通量DNA測(cè)序檢測(cè)胎盤(pán)組織中染色體情況。NIPT檢測(cè)結(jié)果提示染色體非整倍體疾病高風(fēng)險(xiǎn)，而經(jīng)羊水穿刺胎兒染色體核型分析正常，則認(rèn)為NIPT假陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1NIPT檢測(cè)

10236例孕婦，IPT檢測(cè)染色體異常111例，檢出率1.1%。其中21-三體異常34例(30.6%)，18-三體異常20例(18.0%)，13-三體異常17例(15.3%)，性染色體異常35例(31.5%)，其他染色體異常5例(4.5%)。

2.2 不同方法檢測(cè)及妊娠結(jié)局對(duì)比

NIPT檢測(cè)提示異常者行羊膜腔穿刺檢測(cè)復(fù)核，其中確診92例(92/111，82.9%)，未見(jiàn)異常19例(19/111，17.1%)，總假陽(yáng)性率為0.2%(19/10236)。見(jiàn)表1。

表1 不同方法檢測(cè)及妊娠結(jié)局對(duì)比

2.3 假陽(yáng)性原因驗(yàn)證分析

19例NIPT假陽(yáng)性孕婦繼續(xù)妊娠并分娩，經(jīng)與胎盤(pán)組織、母血樣本對(duì)比發(fā)現(xiàn)，12例胎盤(pán)組織檢測(cè)結(jié)果與NIPT結(jié)果一致；5例母血檢測(cè)結(jié)果與NIPT結(jié)果一致； 2例無(wú)法確定NIPT假陽(yáng)性原因。見(jiàn)表2。

表2 19例不同標(biāo)本NIPT檢測(cè)異常原因分析(例)

3 討論

染色體非整倍體疾病是新生兒出生缺陷的主要原因，可通過(guò)產(chǎn)前診斷采取必要終止妊娠[5]。常規(guī)B超檢查和血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法作為染色體異常的篩查手段，孕婦外周血中游離DNA為產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)診斷提供了新的思路。相關(guān)研究證實(shí)[6]，孕婦在孕10周時(shí)外周血即可檢測(cè)到150bps胎兒DNA片段，此片段基本包含胎兒所有基因組序列，通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血游離DNA即可獲得胎兒染色體情況。因此孕婦外周血胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)逐漸成為新生兒出生缺陷產(chǎn)前檢測(cè)的新寵。

我國(guó)衛(wèi)生部于2012年組織NIPT技術(shù)論證，但隨著假陽(yáng)性案例報(bào)道增多，衛(wèi)生部于2014年停止了NIPT檢測(cè)。隨后通過(guò)設(shè)立多家試驗(yàn)點(diǎn)充分臨床評(píng)估后，于2016年發(fā)布有序開(kāi)展NIPT檢測(cè)通知，并對(duì)21-三體、18-三體、13-三體、性染色體等檢出率做出規(guī)定[7]。近年臨床實(shí)踐及研究發(fā)現(xiàn)，NIPT對(duì)染色體異常檢出率不盡相同。紀(jì)巍[8]等報(bào)道NIPT對(duì)21-三體異常預(yù)測(cè)值為100.00%，對(duì)18-三體異常預(yù)測(cè)值為66.67% ，對(duì)13-三體異常預(yù)測(cè)值為50.00%；左娟等[9]報(bào)道NIPT對(duì)21-三體、18-三體、13-三體、性染色體檢出率分別為88.9%、88.9%、50%、83.9%。本研究染色體異常檢出率(1.1%)與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]NIPT陽(yáng)性檢出率較一致。相比傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法，NIPT對(duì)21-三體、18-三體、13-三體、性染色體靈敏度均較高，尤以對(duì)21-三體靈敏度最高。本研究通過(guò)與羊水穿刺胎兒染色體核型分析結(jié)果對(duì)比，顯示NIPT總體假陽(yáng)性率(0.2%)與羅麗等雙[12]報(bào)道結(jié)果一致。提示NIPT并非對(duì)所有染色體異常陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均持續(xù)敏感，考慮NIPT對(duì)倒位、易位等染色體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)不敏感，因此會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性，從而影響到檢測(cè)診斷結(jié)果。因此，NIPT雖然是一種較好的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷手段，但并不能徹底取代產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)核型分析方法。

相關(guān)研究證實(shí)胎兒與胎盤(pán)的組織遺傳物質(zhì)相同[13]。而孕婦外周血游離DNA絕大部分來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞，故正常情況下通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血胎兒游離DNA可獲得與胎兒組織相同的檢測(cè)結(jié)果。然而，胎盤(pán)細(xì)胞系增殖過(guò)程可能出現(xiàn)有絲分裂錯(cuò)誤，形成部分異常染色體組織結(jié)構(gòu)，并與正常染色體胎盤(pán)組織結(jié)構(gòu)嵌合在一起，形成限制性胎盤(pán)嵌合體，胎兒染色體核型依舊正常。這種情況下若胎盤(pán)異常染色體細(xì)胞釋放游離DNA，經(jīng)NIPT檢測(cè)即可發(fā)現(xiàn)異常，而胎兒染色體正常，即為假陽(yáng)性。本研究中19例假陽(yáng)性中12例胎盤(pán)組織檢測(cè)結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，提示限制性胎盤(pán)嵌合體導(dǎo)致胎盤(pán)來(lái)源染色體異常是NIPT假陽(yáng)性的主要因素之一。孕婦外周血游離DNA大部分來(lái)源于母體，雖然經(jīng)過(guò)嚴(yán)格分離與純化處理，但樣本中仍會(huì)存在部分DNA片段影響胎兒游離DNA檢測(cè)，同樣會(huì)表現(xiàn)NIPT假陽(yáng)性。此外，女性擁有兩條X染色體，外周血中可能存在小片段染色體缺失或重復(fù)，從而檢測(cè)孕婦外周血游離DNA時(shí)常見(jiàn)染色體異常[14]。本研究19例NIPT假陽(yáng)性中5例母血檢測(cè)結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，且其中4例為性染色體異常假陽(yáng)性，說(shuō)明母血異常DNA可能是導(dǎo)致NIPT假陽(yáng)性的另一原因。臨床公認(rèn)NIPT適用孕周為12～26周，由于NIPT檢測(cè)所需胎兒游離DNA并非來(lái)源于胎兒本身而是胎盤(pán)，游離DNA含量<4%時(shí)NIPT假陽(yáng)性率高。因此必須要求孕周>12周才能保證充足游離DNA以滿足檢測(cè)要求[15]。而<26周則是為產(chǎn)前診斷預(yù)留充分時(shí)間以備相應(yīng)干預(yù)。本研究中2例孕11周接受NIPT檢測(cè)均為假陽(yáng)性，可能與NIPT檢測(cè)時(shí)孕周不足12周導(dǎo)致外周血胎兒游離DNA量不足所致。需要說(shuō)明的是，由于本研究中NIPT假陽(yáng)性病例樣本量少，發(fā)生機(jī)理及確切原因仍需深入研究。

總之，NIPT在產(chǎn)前胎兒染色體異常診斷中具有較高檢出率，但不排除假陽(yáng)性可能須引起足夠重視。研究結(jié)果初步揭示胎盤(pán)中異常游離DNA進(jìn)入母血、母血已有異常游離DNA以及孕周不足是導(dǎo)致NIPT假陽(yáng)性的主要原因，提示臨床實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格NIPT檢測(cè)規(guī)范，確保NIPT檢測(cè)有效性。針對(duì)NIPT假陽(yáng)性問(wèn)題必須聯(lián)合其他檢測(cè)手段排除胎兒染色體異?？赡?。