22種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的毒殺活性

姬妍茹，董 艷，張正海，石 杰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

0 引 言

根結(jié)線蟲是植物侵染性病害的重要病原物之一，寄主范圍廣，發(fā)生面積大，危害嚴(yán)重?？蓞f(xié)同促進(jìn)真菌和細(xì)菌侵染植物，從而誘發(fā)其他植物病害，造成農(nóng)作物減產(chǎn)，難以根治[1]。目前，根結(jié)線蟲的防治主要是微生物結(jié)合化學(xué)防治為主，1.8%阿維菌素乳油和10%噻唑磷顆粒劑常用于防治黃瓜根結(jié)線蟲[2]。隨著綠色環(huán)保理念的發(fā)展，線蟲防治已由化學(xué)殺滅為主發(fā)展為綜合治理，原則上以減少經(jīng)濟(jì)損失為前提，強(qiáng)調(diào)生物防御，重視生物防治與生態(tài)防控手段的結(jié)合使用，弱化化學(xué)農(nóng)藥的使用，在宏觀上保持寄生線蟲與植物之間的動(dòng)態(tài)平衡[3]，保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。

生物農(nóng)藥是生物防治的主要手段，是利用生物活體或其代謝產(chǎn)物加工而成的可殺滅有害生物的制劑。植物源殺線蟲劑是其中一員，其源于天然植物，容易降解，對(duì)環(huán)境友好，無污染，符合現(xiàn)代農(nóng)藥的研究理念和發(fā)展目標(biāo)[4]，因而成為目前生物農(nóng)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。自然界植物種類豐富，已知有50萬種之多，主要化學(xué)成分被檢測(cè)分析的僅有10%[5]，其中約有2 400種植物對(duì)有害生物具有抑殺活性[6]。植物是天然產(chǎn)物的寶庫，生長進(jìn)化過程中難免受到有害昆蟲的侵害，長期的被動(dòng)防御刺激，促使植物體內(nèi)產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，已知的有生物堿、類黃酮等40萬種[7]。植物的種類不同，生長環(huán)境不同，體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物種類自然有所不同。研究不同種屬植物的藥理特性，從中篩選具有殺線蟲功效的植物，明確其有效活性物質(zhì)，一方面可以將其直接開發(fā)為植物源殺線蟲劑，另一方面可以作為先導(dǎo)化合物采用人工仿生合成的方式研發(fā)新型生物農(nóng)藥。為了挖掘?qū)€蟲具有毒殺活性的植物資源，以22種具有清熱、解毒功能的植物為原料，以乙醇為溶劑進(jìn)行提取，濃縮獲得粗提物，以采集于大慶大棚的黃瓜根結(jié)線蟲為受體，篩選具有毒殺活性的植物，為研發(fā)新型植物源殺線蟲劑提供理論支撐。

亞當(dāng)·斯密認(rèn)為，人類的“愛”是“有層次的”，而自由市場(chǎng)通過平等自愿的交換，讓人們能夠“以自私為目的，達(dá)成利他的結(jié)果，最終使每個(gè)人都互惠互利”。從制度經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度看，破除以地方政府為代表的政府機(jī)會(huì)主義，重塑政治生態(tài)，有耐于持之以恒、與時(shí)俱進(jìn)地優(yōu)化“規(guī)則”。正如布坎南所指出的那樣：“要改變一種游戲或競(jìng)賽的結(jié)果，改變參加競(jìng)賽的人并不重要，而改變競(jìng)賽規(guī)則最為重要。”

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試線蟲，采自大慶市讓湖路區(qū)宏偉二隊(duì)蔬菜大棚。

供試植物。供試植物一共22種，種類見表1。甘草、白鮮、黃芩、龍膽和蒼術(shù)購自大慶市東風(fēng)新村福瑞邦藥店，其他17種植物為大慶周邊野生植物。采集的樣品經(jīng)60℃烘干，然后粉碎過20目篩，4℃冷藏保存。

表5顯示了不同育肥條件下母羊小腸及胰腺的胰蛋白酶活性。表5結(jié)果可見，TMR組母羊十二指腸和胰腺胰蛋白酶活性顯著高于NG組母羊（P=0.003、P=0.02）；回腸胰蛋白酶活性有高于NG組母羊的趨勢(shì)（P=0.08）；空腸胰蛋白酶活性略高于NG組母羊，但差異不顯著（P=0.46）。

從表1提取率來看，以乙醇為溶劑進(jìn)行超聲提取，不同植物的提取率有所不同。龍膽的提取率最高，為25.31%，漢麻的提取率最低，為4.60%，這可能與提取的植物部位有關(guān)。除小藜和反枝莧外，20種植物乙醇提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的2齡幼蟲均有一定的毒殺活性，顯著高于空白對(duì)照10%丙酮水溶液(P<0.05)，且呈現(xiàn)隨著時(shí)間延長抑殺活性增強(qiáng)的趨勢(shì)(48 h校正死亡率均高于24 h)。有18種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的抑殺活性顯著高于無菌蒸餾水(P<0.05)，白鮮、扁蓄、萬壽菊和酸模葉蓼對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲具有極強(qiáng)的抑殺作用(48 h校正死亡率>80%)，殺線蟲效果明顯。龍葵、甘草、車前草、小薊、漢麻等13種植物提取物對(duì)根結(jié)線蟲也有較強(qiáng)抑殺活性(50%>校正死亡率>80%)，龍膽、苘麻、小藜和反枝莧對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲抑殺活性較弱。

1.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)處理均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±sem)格式表示，采用DPSV 7.05軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較以單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行，并做 Turkey 檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)，表示具有顯著性差異。

試劑與儀器?；瘜W(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱(上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))，F(xiàn)W型高速粉碎機(jī)(濟(jì)南海博實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))，ME204E型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn))，HH-1型恒溫水浴鍋(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司生產(chǎn))。

殺線蟲活性測(cè)定。粗提物水溶液配制：參試植物提取物以丙酮助溶，加無菌水配制成1%(W/V)的溶液，其中丙酮含量為10%(V/V)。以3 cm直徑的培養(yǎng)皿為容器，加入3 mL參試提取物溶液，再加入60條左右的2齡線蟲，25℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h和48 h分別用清水復(fù)蘇2 h，觀察記錄線蟲死亡情況。死亡率的計(jì)算參考文艷華[8]等方法，每個(gè)處理設(shè)3次平行，以10%丙酮無菌水溶液作為空白對(duì)照。

低年級(jí)寫話教學(xué)是學(xué)生學(xué)習(xí)寫作的基礎(chǔ)，也是低年級(jí)學(xué)生學(xué)習(xí)語文的重點(diǎn)之一。在日常寫話教學(xué)中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)低年級(jí)學(xué)生寫話往往語句不完整、用詞不當(dāng)，總是干巴巴的，缺少畫面感。怎樣讓學(xué)生寫話的內(nèi)容變得具體生動(dòng)？我覺得借助文本指導(dǎo)學(xué)生寫話是比較有效的。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品提取。稱取50 g植物樣品粉末，置于500 mL三角瓶中。按照料液比1∶5加入80%乙醇，超聲輔助提取，超聲功率200 W，提取時(shí)間20 min。過濾，濾液在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，計(jì)算提取率，4℃冷藏備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 22種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲2齡幼蟲的抑殺效果

了解到問題的根源，我決定來一招釜底抽薪——我把孩子在校的情況如實(shí)向家長匯報(bào)，并建議家長不要再給孩子零花錢，這樣可以從源頭上對(duì)孩子進(jìn)行控制。我們還商定對(duì)小胡進(jìn)行“無縫”監(jiān)管，每天由家長親自送孩子進(jìn)校門，放學(xué)及時(shí)到校門來接孩子，不給他的任性留時(shí)間。隨后的一個(gè)星期，除了正常上課，小胡必須時(shí)時(shí)跟在我身邊。歷時(shí)一個(gè)多星期的持久“捆綁”戰(zhàn)，終于祛除了他身上的戾氣，他看我的目光也開始帶著敬畏。

根結(jié)線蟲卵囊孵化抑制試驗(yàn)。卵囊的挑取、預(yù)處理及抑制孵化率計(jì)算參照邱雪柏[9]的方法，設(shè)22個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別設(shè)清水和10%丙酮溶液作為對(duì)照。25℃恒溫培養(yǎng)，96 h后檢查孵化出的幼蟲數(shù)，計(jì)算抑制孵化率。

續(xù)表1

2.2 22種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵囊孵化的抑制效果

從圖1可以看出，除小藜和反枝莧外，其余20種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵囊孵化的抑制率均顯著高于空白對(duì)照10%丙酮水溶液(P<0.05)，有13種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵囊的孵化抑制率顯著高于無菌蒸餾水(P<0.05)，白鮮、扁蓄、萬壽菊、酸模葉蓼等14種植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵囊孵化具有較強(qiáng)的抑制作用，96 h時(shí)孵化抑制率均大于50%。其中，孵化抑制率高于70%的植物排序?yàn)榘柞r>扁蓄>萬壽菊>酸模葉蓼。抑制效果顯著性比較來看，白鮮與扁蓄無顯著差異(P>0.05)，扁蓄與萬壽菊之間無顯著差異(P>0.05)，萬壽菊與酸模葉蓼之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵囊孵化抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of plant extractives on oocyst hatching of cucumber root knot nematode

3 結(jié)論與討論

通過18S rDNA特征性序列分析比對(duì)，確定采自大慶大棚的黃瓜根結(jié)線蟲屬于象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii)。分別以此線蟲的2齡幼蟲和卵囊為受體，測(cè)定了22種植物提取物的毒殺活性。結(jié)果表明，參試植物提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵囊均具有一定的毒殺活性，白鮮和扁蓄的毒殺活性最強(qiáng)，48 h 校正死亡率和 96 h 的卵囊孵化抑制率均高于80%。

白鮮的藥用部位為蕓香科植物白鮮的干燥根皮，是中國藥典收錄的多年生草本中藥材[10-11]。白鮮皮味道微苦，有特殊濃烈的羊膻味兒，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕[12-13]的功效。白鮮皮主要的化學(xué)組成成分是生物堿和內(nèi)酯化合物[14-16]，白鮮堿是其重要的活性成分[17-18]。王雨萌[19]以乙醇為溶劑對(duì)白鮮皮進(jìn)行提取，并且鑒定出提取液中含有檸檬苦素、白鮮堿、梣酮和黃柏酮，通過試驗(yàn)證明白鮮皮醇提物對(duì)多種害蟲具有毒殺活性，對(duì)粘蟲、雙斑螢葉甲、綠豆象和菜青蟲有觸殺作用，對(duì)榆紫葉甲有胃毒作用，其有效成分為白鮮堿和梣酮。扁蓄(PolygonumaviculareL.)為蓼科蓼屬植物，全草可入藥，主要活性成分為黃酮類化合物扁蓄甙和槲皮素甙，具有利尿、降壓、抗菌等作用[20-22]。有文獻(xiàn)表明，扁蓄乙醇提取物對(duì)小菜蛾幼蟲和枸杞蚜蟲具有較高的觸殺活性[23-24]。關(guān)于白鮮和扁蓄的乙醇提取物對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺活性未見報(bào)道。

白鮮和扁蓄提取物對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲幼蟲的毒殺和卵囊孵化抑殺率的測(cè)定都是在室內(nèi)離體培養(yǎng)條件下完成的，是否能夠作為殺線蟲劑還需要經(jīng)過盆栽培試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的驗(yàn)證，因?yàn)闅⑾x劑實(shí)際應(yīng)用情況比較復(fù)雜，作物本身的生長情況、土壤條件、溫濕度的不規(guī)律變化等因素都會(huì)影響藥效的發(fā)揮。下一步還將對(duì)白鮮和扁蓄的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，明確具有殺線活性的化學(xué)成分種類，以期發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的新型先導(dǎo)化合物，為人工仿生合成生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。