高通量測(cè)序分析紫萍內(nèi)生細(xì)菌多樣性

李越，郜庭，董佳鑫，周濤，俞燁華

（宿州學(xué)院資源與土木工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

水生植物作為一個(gè)功能群，在淡水生態(tài)系統(tǒng)中占有獨(dú)特的生態(tài)位，不僅能夠通過植物吸收、植物固定和植物提取等機(jī)制來直接轉(zhuǎn)化與降解污染物，而且其根系的代謝活動(dòng)可為各種微生物提供適宜生境［1-2］。其中，內(nèi)生菌通過定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制可逐步在植物體內(nèi)建立起動(dòng)態(tài)平衡體系，并形成具有生態(tài)功能的內(nèi)生群落［3］。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，內(nèi)生菌具有豐富的物種多樣性，其在宿主植物體內(nèi)通過一系列代謝活動(dòng)，增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性，促進(jìn)植物健康生長，提高植物降解污染物速率，對(duì)增強(qiáng)水體凈化能力和維持淡水生態(tài)平衡發(fā)揮重要作用［4-6］。

紫萍（Spirodela polyrrhiza）屬于被子植物門（Magnoliophyta）、單子葉植物綱（Liliopsida）、天南星目（Arales）、浮萍科（Lemnaceae），是一類植株較小的漂浮被子植物，也是世界上最小、生長速度最快、形態(tài)最簡(jiǎn)單的開花植物［5］。紫萍主要漂浮在靜止或緩慢流動(dòng)的清水或污水中，可快速生長和倍數(shù)增長。在理想的生長介質(zhì)和營養(yǎng)條件下，紫萍在2～7 d內(nèi)可生物量翻倍，較高的生物量是紫萍對(duì)水體污染物具有高生物富集潛力的關(guān)鍵條件。污水經(jīng)過紫萍處理后，水體中的重金屬、濁度、生物需氧量、溶解性總固體、總磷、總懸浮固體、磷酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽等都會(huì)有所減少，從而凈化水質(zhì)［6］。目前對(duì)紫萍的研究多局限于植物對(duì)高濃度的環(huán)境污染物的敏感性、非生物脅迫和植物對(duì)離子及化合物的生物利用度等，而對(duì)紫萍與微生物共生來增加水體環(huán)境中各種污染物的植物修復(fù)效率方面研究較少，紫萍內(nèi)生細(xì)菌的資源挖掘更是鮮有報(bào)道［7-8］。宿州市新汴河中紫萍自然發(fā)育，生物數(shù)量大，其內(nèi)生細(xì)菌特殊的微生態(tài)生境決定了理論研究的廣度和深度以及巨大的應(yīng)用潛力，是個(gè)尚待全面系統(tǒng)深入研究和開發(fā)的新型微生物資源。

高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）的使用為揭示自然界微生物的多樣性提供了便利，使研究者能更全面、更精確的測(cè)定生境中各類微生物的相對(duì)豐度。本項(xiàng)目旨在通過高通量測(cè)序技術(shù)揭示新汴河水域中紫萍的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)行微生物群落多樣性分析及功能預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從朱仙莊煤礦區(qū)的新汴河中采集紫萍。將采集的紫萍種質(zhì)帶回實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水沖洗干凈后，挑選葉狀體與不定根完整的紫萍，于霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d。

1.2 樣品消毒

取250 mg鮮重紫萍，在無菌條件下，70%乙醇表面消毒15 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞浸泡5 min，無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙吸干水分。同時(shí)，取100μL最后一次沖洗的無菌水涂布于LB、869、284、NB、R2A平板［9］，平板倒置后于30°C下培養(yǎng)72 h，以檢測(cè)植物材料表面消毒是否徹底。如果培養(yǎng)基表面出現(xiàn)污染，則棄用該植物材料。樣品于-80°C保存。

1.3 總DNA提取

紫萍以及體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌的總DNA，采用改進(jìn)的CTAB法進(jìn)行提取。將表面消毒完善的樣品置于液氮中速凍，用預(yù)冷過的無菌研缽研磨成細(xì)粉末。再將粉末狀材料轉(zhuǎn)移至2 mL Eppendorf管內(nèi)，立即加入1.2 mL經(jīng)65°C預(yù)熱的CTAB extraction buffer重懸粉末，65°C水浴1 h，每15 min溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合4～6次。取上清液，加等體積苯酚/氯仿/異戊醇與氯仿/異戊醇各抽提一次。再加入800μL預(yù)冷異丙醇于-20°C沉淀10 min。12 000 rpm離心10 min，用250 μLTE buffer重懸，同時(shí)加入2.5 μL RNase于37°C孵育30 min。加25μL 3M NaAc及600μL預(yù)冷無水乙醇于-20°C沉淀30 min。70%乙醇漂洗沉淀。沉淀干燥后，溶于35 μL TE buffer，-20°C保存樣品。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用巢式引物799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1392R（5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'），799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）擴(kuò)增微生物16S rDNA的V5～V7高變區(qū)［10］。PCR反應(yīng)體 系（20 μ L）如 下：5×FastPfu Buffer 4 μl，2.5mM dNTPs 2 μl，F(xiàn)orward Primer(5 μM)0.8 μl，ReversePrimer(5μM)0.8μl，F(xiàn)astPfuPolymerase0.4μl，BSA 0.2μl，Template DNA 10 ng。PCR一輪擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性3 min，95°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，27個(gè)循環(huán)，72°C終延伸10 min。PCR二輪擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性3 min，95°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，15個(gè)循環(huán)，72°C終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 文庫構(gòu)建

1.6 生物信息學(xué)分析

首先利用Trimmomatic軟件［11］（http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmoat-ic）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制與過濾，再利用FLASH軟件［12］（https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)獲取的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，使用UPARSE軟件［13］（http://drive5.com/uparse/）根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行Operational Taxonomic Units（OUTs）聚類，使用UCHIME軟件［14］剔除嵌合體，最后利用RDP classifier［15］（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫。通過對(duì)OTUs進(jìn)行相對(duì)豐度、α多樣性［16］（chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)）以及物種在分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

早期的分類系統(tǒng)［17］將浮萍科分類為天南星目下一個(gè)科，而近期的分類系統(tǒng)則將浮萍科并入到天南星科內(nèi)，同時(shí)將天南星科分類為澤瀉目下的一個(gè)科。根據(jù)根的數(shù)目和葉的形狀進(jìn)行區(qū)分，浮萍亞科可分為5個(gè)屬，分別為紫萍屬（Spirodela）、斑萍屬（Landoltia）、青 萍 屬（Lemna）、扁 無 根 萍 屬（Wolffiella）和無根萍屬（Wolffia）。通過浮萍各屬檢索表［18］分析可知，從新汴河中采集的野生浮萍屬于紫萍屬（圖1）。

圖1 代表性浮萍株系的形態(tài)Fig.1 Morphology of representative strains of giant duckweed

2.2 α-多樣性分析

隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線（圖2A）、Shannon指數(shù)曲線（圖2B）以及Chao1指數(shù)曲線（圖2C）逐漸趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)足夠大，實(shí)驗(yàn)取樣基本合理，置信度較好，基本能夠體現(xiàn)真實(shí)環(huán)境中紫萍內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征。

圖2 多樣性指數(shù)Fig.2 The diversity index

2.3 群落特征解析

在門分類水平，紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要分布于4個(gè)菌門（圖3A），分別是酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中優(yōu)勢(shì)類群為變形菌門（81.60%），而擬桿菌門（12.52%）、放線菌門（2.29%）、酸桿菌門（1.10%）分別為第二、第三、第四優(yōu)勢(shì)菌門。

在綱分類水平，紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要分布于8個(gè)菌綱（圖3B），分別為β–變形菌綱（Betaproteobacteria，48.50%）、α–變形菌綱（Alphaproteobacteria，24.30%）、黃桿菌綱（Flavobacteria，10.19%）、γ–變形菌綱（Gammaproteobacteria，5.86%）、δ–變形菌綱（Deltaproteobacteria，2.30%）、放線菌綱（Actinobacteria，2.29%）、鞘脂桿菌門（Sphingobacteria，1.60%）和 酸 桿 菌 綱（Acidobacteria，1.10%）。

在目分類水平，紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要分布于12個(gè)菌目（圖3C），分別為伯克氏菌目（Burkholderiales，42.75%）、根瘤菌目（Rhizobiales，11.00%）、黃桿菌目（Flavobacteriales，10.19%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales，5.08%）、嗜甲基菌目（Methylophilales，4.13%）、紅細(xì)菌目（Rhodobacterales，3.06%）、柄桿菌目（Caulobacterales，2.89%）、黃單胞菌目（Xanthomonadales，2.49%）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales，1.60%）、紅螺菌目（Rhodospirillales，1.12%）、纖維弧菌目（Cellvibrionales，1.08%）和索利氏菌目（Solibacterales，1.02%）。

在科分類水平，紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要分布于16個(gè)菌科（圖3D），分別為叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，41.25%）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae，9.74%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，5.34%）、嗜甲基菌科（Methylophilaceae，4.13%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，3.87%）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae，3.06%）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae，2.79%）、柄 桿 菌 科（Caulobacteraceae，1.56%）、生 絲 單 胞 菌 科（Hyphomonadaceae，1.33%）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae，1.27%）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、纖維弧菌科（Cellvibrionaceae，1.06%）、赤桿菌科（Erythrobacteraceae，1.03%）、索利氏菌科（Solibacteraceae，1.02%）以及不能分類的屬于伯克氏菌目中的菌科（1.21%）。

圖3 基于Circos圖的紫萍內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The endophytic bacterial community of giant duckweed based on Circos diagram

在屬分類水平，紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要（圖3）分布于17個(gè)菌屬（圖3E），分別為污泥單胞菌屬（Pelomonas，9.27%）、黃桿菌屬（Flavobacterium，9.12%）、紅長命菌屬（Rubrivivax，6.54%）、氫噬菌屬（Hydrogenophaga，6.34%）、水庫桿菌屬（Piscinibacter，6.25%）、根瘤菌屬（Rhizobium，4.87%）、艾德昂菌屬（Ideonella，4.24%）、嗜甲基菌屬（Methylophilus，2.57%）、紅細(xì)菌屬（Rhodobacter，1.99%）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium，1.89%）、食酸菌屬（Acidovorax，1.54%）、甲基嬌養(yǎng)桿菌屬（Methylotenera，1.52%）、芽單胞菌屬（Blastomonas，1.22%）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis，1.13%）、纖維弧菌屬（Cellvibrio，1.06%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，1.03%）和不能分類的屬于伯克氏菌目中的菌屬（1.21%）以及屬于叢毛單胞菌科的菌屬（6.84%）。

3 討論

假單胞菌廣泛分布于土壤、淡水和海洋中，種類繁多，對(duì)有機(jī)物質(zhì)的礦化起重要作用，而且是植物根際土壤周圍起生物防治功能的主要細(xì)菌類群。除了能改善宿主植物微環(huán)境和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等生物防治作用，假單胞菌還能降解有毒物質(zhì)，其中污泥單胞菌屬便是與有機(jī)物去除最相關(guān)的異養(yǎng)菌［5］；黃桿菌屬具有促進(jìn)水生植物生長的作用［19］；紅長命菌屬細(xì)菌可在光照厭氧條件下，利用各種有機(jī)化合物作電子供體進(jìn)行光異養(yǎng)生長，或在氫、二氧化碳及生長因子存在時(shí)，進(jìn)行光自養(yǎng)生長。以二氧化碳作唯一的碳源和能源時(shí)，可在黑暗條件下進(jìn)行化能自養(yǎng)生長，也可利用各種有機(jī)化合物進(jìn)行好氧化能異養(yǎng)生長［20］；氫噬菌屬屬于兼性嗜氫自養(yǎng)菌，以氧為末端電子受體的氧化型的糖代謝，有的種還具有厭氧硝酸鹽呼吸而進(jìn)行反硝化作用［21］；水庫桿菌屬具有堿性磷酸酶活性，能分泌植物生長素吲哚乙酸［22］；根瘤菌侵入宿主植物根內(nèi)，刺激根部皮層和中柱鞘的細(xì)胞生長，引起根局部膨大而形成根瘤，宿主植物供給根瘤菌以礦物養(yǎng)料和能源，而根瘤菌則可固定大氣中游離氮?dú)舛鵀橹参锾峁┑仞B(yǎng)料［23］；艾德昂菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生酶而逐步降解聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料，使之作為營養(yǎng)源生存并繁殖［24］；嗜甲基菌屬與甲基嬌養(yǎng)桿菌屬都具有廣泛的有機(jī)物代謝能力，可以利用許多有機(jī)酸、醇類和芳香族化合物［25］；紅球菌屬可以分泌大量的活性酶，能夠充分利用有機(jī)物作為能源和碳源［26］；生絲微菌屬為化能有機(jī)營養(yǎng)菌，可利用甲醇、甲胺、甲醛和甲酸等碳化合物作為惟一碳源和能源［27］；食酸菌屬可以進(jìn)行反硝化脫氮［4］；由于纖維素酶等的作用，纖維弧菌屬可以將纖維素一直分解到葡萄糖為止，有時(shí)在分解過程中會(huì)積累纖維二糖，在降解纖維素過程中發(fā)揮重要作用［28］；鞘氨醇單胞菌屬是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解。該屬菌株憑借自身的高代謝能力與多功能的生理特性，在環(huán)境保護(hù)及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力［29］。

4 結(jié)論

水生植物資源豐富，通過植物內(nèi)生菌培養(yǎng)技術(shù)以及分子微生態(tài)學(xué)技術(shù)手段的應(yīng)用研究，現(xiàn)已解析了多種水生植物內(nèi)生細(xì)菌的物種多樣性。目前可粗略統(tǒng)計(jì)水生植物內(nèi)生細(xì)菌分屬于約150屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）等在水生植物體內(nèi)具有普遍存在性［6］。但本研究發(fā)現(xiàn)紫萍內(nèi)生細(xì)菌主要由污泥單胞菌屬、黃桿菌屬、紅長命菌屬、氫噬菌屬、水庫桿菌屬、根瘤菌屬、艾德昂菌屬、嗜甲基菌屬、紅細(xì)菌屬、生絲微菌屬、食酸菌屬、甲基嬌養(yǎng)桿菌屬、芽單胞菌屬、不粘柄菌屬、纖維弧菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等菌屬組成，這進(jìn)一步完善了水生植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的研究。另外，紫萍內(nèi)生細(xì)菌可能參與水體中氮循環(huán)、磷循環(huán)以及有機(jī)復(fù)合物降解過程，將有助于植物修復(fù)，從而在淡水生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。