基于網(wǎng)絡藥理學的爵床抗腫瘤活性成分及作用機制研究

胡進 陳輝 張歡 謝周濤

中藥爵床為爵床科植物爵床Rostellularia procumbens （L.） Nees的干燥全草，是傳統(tǒng)的中草藥。爵床具有清熱解毒、利尿消腫之功效，臨床用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、痢疾、腸炎、腎盂腎炎等癥，外用治療癰瘡癤腫等[1]。爵床全草的現(xiàn)代研究表明，其主要化學成分為木脂素及其苷類、黃酮類、生物堿、三萜類化合物等?，F(xiàn)代藥理研究表明，爵床具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性[2]，目前爵床的藥理作用研究仍不夠系統(tǒng)與全面。

網(wǎng)絡藥理學作為一種系統(tǒng)性、整體性的研究藥物、疾病、靶點之間相互關系的分析方法，與中藥多成分、多靶點、多途徑作用特征相吻合，可系統(tǒng)發(fā)掘中藥潛在活性成分和作用靶點[3，4]。我們采用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，預測爵床抗腫瘤的活性成分、治療靶點和信號通路，并使用分子對接進行驗證。

1 材料與方法

1.1 化學成分庫構建通過檢索國內(nèi)外相關文獻，構建爵床的化學成分庫，結合 Pubchem數(shù)據(jù)庫，采用 Chemoffice軟件繪制成分的化學結構并保存為MOL2格式。

1.2 活性成分篩選藥物的體外篩選模型主要涉及藥物的腸吸收、血腦屏障滲透性、體外代謝、藥物相互作用和各種體外毒性模型等，并以人體腸道吸收（HIA）、Caco-2細胞滲透性（簡稱Caco-2）和血漿蛋白結合（PPB）作為關鍵參數(shù)進行篩選[5]。將該格式的化合物導入 https://preadmet.bmdrc.kr/網(wǎng)站，計算并預測藥物吸收、分布及代謝。篩選出HIA大于20，Caco-2滲透性大于4和PPB大于70的所有化學成分作為候選藥效成分。

1.3 藥效成分靶點預測將篩選好的各成分的MOL2結構導入 Pharm Mapper服務器中，采用反向藥效團匹配方法進行靶點預測，將匹配得分靠前的靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行檢索，限定物種為人，對靶點名稱進行統(tǒng)一。

1.4 疾病相關靶點篩選通過 GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“cancer”，得到與腫瘤相關的基因，最后導入 Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名標準化處理后歸納整理，獲得腫瘤潛在相關基因靶點。

1.5 構建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡將潛在靶點導入 String數(shù)據(jù)庫，獲得PPI關系，設置置信度大于0.900，隱藏無PPI關系的靶點，以 TSV格式保存結果，再將數(shù)據(jù)導入 Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化處理和分析。

1.6 靶點通路注釋分析KEGG（Kyoto encyclopediaof genes and genomes）在網(wǎng)絡藥理學中常用于信號通路的注釋，對靶點基因進行通路注釋，可以了解靶點基因參與的信號通路。Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫涵蓋的生物學包括：細胞組分（Cell component，CC）、分子功能（Molecular function，MF)、生物過程（Biological process，BP）3個方面。將所有潛在靶點基因上傳至 DAVID數(shù)據(jù)庫，進行 KEGG通路注釋與 GO富集。設置閾值P＜0.05，根據(jù)P值排序保留得分靠前的結果，并進行可視化分析。

1.7 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建利用Cytoscape 3.6.1軟件構建靶點基因-活性成分網(wǎng)絡及靶點基因-富集通路網(wǎng)絡，網(wǎng)絡節(jié)點表示活性成分、作用靶點及作用通路，網(wǎng)絡邊表示兩節(jié)點之間存在關聯(lián)。通過構建網(wǎng)絡模型研究爵床多成分、多靶點、多通路的抗腫瘤作用機制。

1.8 分子對接從PBD數(shù)據(jù)庫下載度值較高的靶點蛋白結構文件（PBD格式），利用 AutoDockTools軟件對下載的靶蛋白進行加氫、加電子等前處理；靶點與活性成分進行 AutoDock分子對接驗證實驗，同時遴選陽性藥進行分子對接，以此結合能比較靶點和活性成分結合的性能。

2 結果

2.1 藥效成分篩選通過篩選共得到 27種候選藥效成分，其中有17個為木質(zhì)素類成分，如 Justicidin C等；5個三萜類化合物，如friedelin；4個為黃酮類成分，如kaempferol；1個有機酸化合物，如 Palmitic acid。見表1。

表1 藥效成分篩選結果

2.2 腫瘤相關靶點的篩選分析通過 GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“cancer”，得到與腫瘤相關的基因，最終得到腫瘤靶點基因 1 480個，選取得分≥20的 397個基因進行分析。得分位于前10的基因為BRCA2、BRCA1、TP53、CDH1、MLH1、MSH2、MSH6、APC、ATM、PTEN。

2.3 PPI網(wǎng)絡構建與分析將活性成分作用的潛在靶點與腫瘤相關疾病基因進行比對，獲得爵床抗腫瘤活性成分潛在靶點基因，共得到54個與腫瘤聚集相關的基因數(shù)據(jù)，見表2。使用 Network Analyse功能對PPI網(wǎng)絡進行分析，見圖1。圖中共有54個節(jié)點，176條邊，平均度值為6.52。在PPI網(wǎng)絡中度值較高的靶點有SRC、蘇氨酸激酶1（Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、PIK3R1、PTPN11等。

圖1 PPI網(wǎng)絡圖

表2 爵床抗腫瘤活性成分潛在靶點基因

續(xù)表2

2.4 活性成分潛在靶點的通路注釋利用 DAVID數(shù)據(jù)庫對爵床抗腫瘤的靶點進行富集分析，將P＜0.05作為注釋結果的篩選條件并繪圖。

GO功能富集分析結果顯示，在BP與正調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄、正調(diào)控細胞增殖、負調(diào)控 RNA聚合酶Ⅱ促進轉(zhuǎn)錄相關性最大；MF與生長因子活性、ATP結合、受損 DNA結合相關性最大；CC與細胞外空間、核漿、細胞質(zhì)相關性最大。見圖2～4。

圖2 GO功能富集 BP分析

圖3 GO功能富集 CC分析

圖4 GO功能富集 MF分析

KEGG通路注釋結果顯示，有96條抗腫瘤相關信號通路，排名前十的通路為：PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、催乳激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路和MAPK信號通路。見圖5。

圖5 相關通路 KEGG富集分析

2.5 “活性成分－靶點－通路”網(wǎng)絡構建分析選取了 27個活性成分、53個靶點基因和 KEGG通路分析的 15條通路，構建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。該網(wǎng)絡共包含 95個節(jié)點， 456條邊，見圖 6。

圖6 活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡分析圖

2.6 分子對接驗證結合文獻分析選擇排名靠前的基因，選擇 AKT1、MAPK1兩個靶點作為分子用于對接實驗。從PBD數(shù)據(jù)庫中分別選擇了3O96（AKT1），5NHO（MAPK1）作為對接的蛋白結構。選擇度值較高的化合物Chinensinaphthol，Diphyllin，Taiwanin E，tormentic acid與上述2個靶點蛋白進行分子對接 ;通過文獻分析并結合當前的研究熱點，選取了 ulixertinib、resveratrol分別作為MAPK1、AKT1蛋白靶點的陽性對照藥，以結合能判斷化合物與靶點蛋白的親和力。見表3。

表3 有效成分與核心靶點的分子對接

3 討論

腫瘤已經(jīng)成為嚴重影響人類生命健康的常見疾病，近年來其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)不斷上升趨勢。中醫(yī)學歷史悠久，在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和防治方面已形成了特色鮮明的腫瘤學科體系，在預防腫瘤發(fā)生以及減毒增效、抗耐藥、防止復發(fā)轉(zhuǎn)移等方面具有明顯優(yōu)勢，已成為防治腫瘤疾病不可或缺的重要醫(yī)療措施[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)爵床的主要抗腫瘤活性成分有山荷葉素（Diphyllin）、委陵菜酸（Tormentic acid）、木犀草苷等化學成分。Diphyllin屬于木脂素類化合物，有研究證明具有較好的抗腫瘤活性，且對正常細胞毒性小[7]。Tormentic acid可誘導白血病細胞的凋亡，導致細胞核固縮以及核碎裂，提高了其細胞中Caspase-3的表達水平，促進了細胞色素 C的釋放，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用[8]。木犀草苷的低、中、高劑量組對 A431細胞的增殖抑制率上升，遷移和侵襲細胞數(shù)均降低。沈琴等[9]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草苷可抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲 ,可能與其促進 ST7L基因表達有關。

基于 PPI網(wǎng)絡分析可知爵床抗腫瘤的主要靶點為 SRC、Akt1、MAPK1、PIK3R1、PTPN11等。SRC基因是具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的人類癌基因，SRC蛋白能介導生長因子、黏附因子、趨化因子等多條下游信號通路[10]。研究表明，SRC的過度表達和活化，在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、細胞增殖、遷移及侵襲等方面起著十分重要的作用[11～13]。MAPK1作為 MAPK家族中的一員，在腫瘤的增殖、分化和侵襲過程中也發(fā)揮著十分重要的作用[14，15]。Lei等[16]研究表明，MAPK1的表達上調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著十分密切的聯(lián)系。

從通路富集結果可知，爵床抗腫瘤的主要通路有PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路等。 PI3KAkt通路可在多種腫瘤中引發(fā)細胞生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成[17]。Hirashima等[18]研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路可刺激食管癌增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，所以激活PI3K-Akt通路可促進食管癌進展。Rap1信號通路調(diào)控細胞黏附、遷移及血管生成等，其過程與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著非常強的相關性[19，20]。FoxO信號通路與細胞凋亡有著十分密切的相關性，F(xiàn)oxO家族參與線粒體依賴性和非依賴性的凋亡過程，因而激活死亡受體配體的表達[21]。雌激素在肝細胞癌中具有保護性作用，雌激素可抑制炎癥誘導的肝細胞癌發(fā)生，其介導各種致癌信號通路的抑制[22～25]。以上研究結果都驗證了雌激素在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的調(diào)控作用。

綜上所述，抗腫瘤的作用機制復雜，涉及多個基因與多個信號通路。本研究借助中藥網(wǎng)絡藥理學的方法，初步預測爵床的主要活性成分、靶點與抗腫瘤的相關靶點，為爵床有效成分的篩選及深入研究提供一定科學依據(jù)。