奧希替尼治療脊髓損傷的機(jī)制研究*

李在望， 曹婷婷， 王 倩， 涂景梅， 韓 晶△

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518020 2江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鹽城 224001

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)常導(dǎo)致永久性的神經(jīng)功能缺損，給患者的生活質(zhì)量帶來災(zāi)難性的后果。SCI在各國均有較高的發(fā)病率，我國患病率為(23.7～60.6)/100萬，且每年新增SCI病例高達(dá)60000例[1]。而SCI后神經(jīng)損傷的病理生理機(jī)制目前尚未完全闡明，且醫(yī)學(xué)界尚無有效的治療方法[2]。

機(jī)械暴力損傷脊髓可導(dǎo)致血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)嚴(yán)重破壞，失去正常屏障功能，從而引發(fā)血液中的白細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)組織并分泌大量致炎因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、環(huán)氧化酶2(COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等[3]。這些致炎因子可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[4]，最終引發(fā)反應(yīng)性神經(jīng)毒性炎癥損傷，導(dǎo)致髄鞘脫失[5]和脊髓繼發(fā)損傷進(jìn)一步加重[6]。而且致炎因子還可導(dǎo)致BSCB中緊密連接蛋白(ZO-1和Occludin)的脫失，進(jìn)而加重BSCB的損傷[7]，因此，SCI后反應(yīng)性炎癥損傷在脊髓繼發(fā)損傷中起著至關(guān)重要的作用[8]。如何有效抑制SCI后的過度炎癥反應(yīng)是干預(yù)SCI的一個(gè)重要策略。

已有研究證實(shí)，表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑可抑制SCI后過度膠質(zhì)增生導(dǎo)致的反應(yīng)性神經(jīng)毒性炎癥損傷[9-10]，而奧希替尼是第3代EGFR抑制劑，具有良好的血腦屏障滲透性，能有效地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11]。因此，我們擬用奧希替尼干預(yù)脊髓損傷大鼠模型，觀察其對(duì)SCI早期(3、7 d)致炎因子(IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS)及緊密連接蛋白(ZO-1和Occludin)表達(dá)的影響，并分析其對(duì)炎癥引發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)活化增生的影響，同時(shí)研究其對(duì)SCI后髄鞘脫失的作用，評(píng)估其對(duì)SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用。該研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用EGFR抑制劑干預(yù)SCI提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雌性SD大鼠(200～250 g)60只，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑與材料 奧希替尼購于MCE公司，兔抗COX-2、兔抗iNOS、兔抗ZO-1、兔抗Occludin、兔抗GFAP抗體購于Invitrogen公司，兔抗EGFR、兔抗p-EGFR、鼠抗CD11b、鼠抗GAPDH抗體購于英國Abcam公司，鼠抗IL-1β、鼠抗TNF-α抗體購于美國R&D公司，羊抗兔Cy3、羊抗鼠Cy3購于武漢博士德生物工程有限公司，勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol Fast Blue)染色試劑盒購于美國GenMed Scientifics公司。

1.2 大鼠脊髓損傷模型的制備及分組

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組(假手術(shù)組，損傷組和奧希替尼組)，每組20只。選擇T10解剖標(biāo)志，消毒鋪無菌巾后行背部正中切口，切斷T9～T11棘突上的韌帶，暴露T9～T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜。假手術(shù)組大鼠不予打擊損傷，止血后依次縫合豎脊肌、皮下組織及皮膚，碘伏清理局部皮膚，外用紅霉素預(yù)防感染。損傷組和奧希替尼組大鼠，應(yīng)用固定器固定T9、T11棘突，調(diào)整好打擊棒的高度[打擊棒重量為10 g，其打擊頭直徑為2 mm，打擊高度為1.25 cm，下落打擊致傷能量為25 gcf(gram centimeter force)]，啟動(dòng)開關(guān)，打擊棒自由落下(確保打擊棒與脊髓垂直)，致傷后迅速移去打擊棒，可見打擊處硬脊膜形成血腫，并可見大鼠雙下肢痙攣抖動(dòng)，尾巴痙攣性擺動(dòng)(此為造模成功的體征)，遂行肌肉和皮膚縫合，消毒、復(fù)溫后將大鼠放回籠中。造模后，奧希替尼組給予濃度為0.4 mg/mL奧希替尼溶液灌胃(2 mL/d)，假手術(shù)組和損傷組給予生理鹽水灌胃(2 mL/d)，均干預(yù)1周。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)緊密連接蛋白及致炎因子的表達(dá)

每組取5只大鼠于致傷后3、7 d快速剝?nèi)p傷節(jié)段脊髓組織，加入裂解液冰上孵育并徹底勻漿，離心后留取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%封閉液(1 g奶粉+20 mL TBST)封閉2 h，分別加入一抗(以GAPDH為內(nèi)參)，4℃孵育過夜；用TBST溶液洗滌10 min×3次，加入二抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加ECL發(fā)光顯示液在暗室中攝像，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量分析。

1.4 免疫熒光染色

大鼠脊髓損傷后第7天，每組隨機(jī)取3只大鼠，深度麻醉后自左心室快速灌注生理鹽水沖洗，待流出清亮液體后，灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)固定1 h，切取損傷節(jié)段長約1.0 cm的脊髓，置于PB液中，固定4 h后，置于含20%蔗糖的PB中4℃過夜。待脊髓組織沉底后取出并進(jìn)行冰凍切片(切片厚10 μm)。將切片固定于多聚賴氨酸包被的玻片上，以5%山羊血清封閉1 h，分別滴加一抗[兔抗GFAP(1∶100稀釋)、鼠抗CD11b(1∶200稀釋)]，4℃孵育過夜。PBS洗5 min×3次，分別滴加二抗[羊抗兔Cy3(1∶400稀釋)、羊抗鼠Cy3(1∶400稀釋)]，37℃作用1 h，PBS洗5 min×3次，甘油封片。熒光顯微鏡下攝像，彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.5 脊髓組織髓鞘Luxol Fast Blue染色

大鼠脊髓損傷后第14天，每組取3只大鼠，將含損傷部位的各組脊髓組織軸位水平切成20 μm的切片，染色操作過程按Luxol Fast Blue染色試劑盒說明操作。Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡下攝像，Image Pro Plus分析軟件分析髓鞘脫失面積，以脊髓損傷中心處切片來比較各組髓鞘脫失的面積。

1.6 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估

由2名經(jīng)專門培訓(xùn)的研究人員(對(duì)分組不知情)應(yīng)用BBB量表在開放式場(chǎng)地對(duì)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)分(術(shù)后當(dāng)天及以后每周1次，每組5只大鼠)。其中BBB量表的評(píng)分范圍為從0分(弛緩性麻痹)到21分(正常步態(tài))。

1.7 排尿功能評(píng)估

SCI后，每日人工按摩膀胱2次，協(xié)助大鼠排出殘余尿，用小燒杯收集尿液并記錄尿量，直到自主膀胱功能恢復(fù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0、Graphpad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，運(yùn)動(dòng)功能和殘余尿量評(píng)估應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 致炎因子的表達(dá)

在SCI后3、7 d，損傷組的致炎因子(TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS)表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(均P<0.01)，而奧希替尼干預(yù)組致炎因子表達(dá)量明顯低于損傷組(均P<0.05)，見圖1。

1：假手術(shù)組；2：奧希替尼組；3：損傷組；A：SCI后3、7 d TNF-α，IL-1β，iNOS和COX-2表達(dá)的Western blot代表圖；B：SCI后3 d致炎因子表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：SCI后7 d致炎因子表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05 **P<0.01圖1 EGFR抑制劑奧希替尼下調(diào)脊髓損傷組織致炎因子的表達(dá)Fig.1 The EGFR inhibitor osimertinib down-regulated the expression of inflammatory factors

2.2 緊密連接蛋白表達(dá)

SCI后3、7 d，損傷組緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(均P<0.01)，而奧希替尼組的ZO-1和Occludin表達(dá)量均較損傷組明顯增加(均P<0.05)，見圖2。

1：假手術(shù)組；2：奧希替尼組；3：損傷組；A：SCI后3、7 d緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的Western blot代表圖；B：SCI后3 d緊密連接蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖；C：SCI后7 d緊密連接蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05 ** P<0.01圖2 EGFR抑制劑奧希替尼減輕SCI后微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的脫失Fig.2 The EGFR inhibitor osimertinib alleviated the loss of tight junction proteins in microvascular endothelial cells after SCI

2.3 EGFR磷酸化

SCI后3、7 d損傷組EGFR活化較假手術(shù)組明顯增加(均P<0.01)，而奧希替尼干預(yù)后EGFR活化較損傷組明顯減少(均P<0.05)，見圖3。

1：假手術(shù)組；2：奧希替尼組；3：損傷組；A：SCI后3、7 d各組p-EGFR、EGFR表達(dá)的Western blot代表圖；B：SCI后3、7 d p-EGFR表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05 **P<0.01圖3 EGFR抑制劑奧希替尼有效抑制損傷脊髓組織中EGFR的活化Fig.3 The EGFR inhibitor osimertinib effectively inhibited EGFR activation

2.4 膠質(zhì)細(xì)胞增生

脊髓損傷后7 d，損傷組GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)及CD11b(小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(均P<0.01)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化、增生(圖4)。而奧希替尼組GFAP及CD11b表達(dá)明顯低于損傷組(均P<0.05)，表明奧希替尼可以有效抑制SCI后膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖4)。

1：假手術(shù)組；2：奧希替尼組；3：損傷組；A：SCI后7 d損傷脊髓組織的免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm；B：SCI后7 d各組GFAP、CD11b表達(dá)的Western blot代表圖；C：SCI后7 d GFAP、CD11b表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05 **P<0.01圖4 EGFR抑制劑奧希替尼抑制SCI后膠質(zhì)細(xì)胞增生Fig.4 The EGFR inhibitor osimertinib effectively inhibited gliosis after SCI

2.5 髄鞘脫失

SCI后14 d，假手術(shù)組脊髓的髓鞘組織均勻著色，提示髄鞘組織完整；而損傷組中脊髓損傷中心區(qū)見大片無著色區(qū)域；奧希替尼組脊髓組織損傷區(qū)無著色的范圍明顯縮小(與損傷組比較，P<0.05)，見圖5。

A：脊髓組織Luxol Fast Blue染色，標(biāo)尺=1 mm；B：奧希替尼組和損傷組脊髓組織髓鞘脫失面積比較，*P<0.05圖5 EGFR抑制劑奧希替尼抑制SCI后髓鞘脫失Fig.5 The EGFR inhibitor osimertinib inhibited demyelination after SCI

2.6 運(yùn)動(dòng)功能及排尿功能評(píng)估

SCI后，損傷組和奧希替尼組大鼠BBB評(píng)分均接近0分，提示兩組損傷程度無差異。而1周后兩組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均有提高，但奧希替尼組BBB評(píng)分增加幅度明顯高于損傷組，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示：兩組評(píng)分存在顯著差異(P<0.05)。殘余尿量分析提示SCI后1 d損傷組和奧希替尼組均出現(xiàn)大量殘余尿量(約5 mL/d)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而奧希替尼組在SCI后第6天殘余尿量開始減少，損傷組殘余尿量至SCI后第8天才開始減少，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示：奧希替尼組殘余尿量明顯少于損傷組(P<0.05)，見圖6。

A：BBB評(píng)分評(píng)估SCI后大鼠運(yùn)動(dòng)功能；B：各組大鼠SCI后殘余尿量變化圖6 EGFR抑制劑奧希替尼促進(jìn)SCI后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)Fig.6 The EGFR inhibitor osimertinib promoted the recovery of motor and urinary function of rats after SCI

3 討論

脊髓損傷(SCI)在各國均有較高的發(fā)病率，SCI后往往會(huì)造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損，常常導(dǎo)致不同程度的肢體癱瘓、大小便及性功能障礙，且這些神經(jīng)功能缺損往往是不可逆的[1]。SCI后神經(jīng)損傷包括原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷指初始機(jī)械暴力作用于脊髓所產(chǎn)生的損傷。繼發(fā)性損傷指外力造成脊髓損傷后引發(fā)的進(jìn)一步病理損害過程，包括水腫、缺血、凋亡、炎癥反應(yīng)、自由基和脂質(zhì)過氧化、軸突再生抑制、膠質(zhì)瘢痕形成等[12]。原發(fā)性損傷不可逆轉(zhuǎn)，因此，抑制繼發(fā)性損傷是干預(yù)脊髓損傷的關(guān)鍵[12]。

SCI后機(jī)械暴力不僅導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷而且引發(fā)血脊髓屏障(BSCB)嚴(yán)重破壞[8]。BSCB的破壞導(dǎo)致血液中的炎癥細(xì)胞及炎癥因子侵入到中樞神經(jīng)組織。這些炎癥細(xì)胞及炎癥因子可導(dǎo)致神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷并進(jìn)一步損傷BSCB，同時(shí)還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致過度膠質(zhì)增生，并釋放大量致炎因子，如TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2等[13-14]。而這些致炎因子同樣會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，引發(fā)反應(yīng)性神經(jīng)毒性炎癥損傷，導(dǎo)致脊髓繼發(fā)損傷進(jìn)一步加重[15]。過度的反應(yīng)性炎癥還可導(dǎo)致非損傷區(qū)的BSCB破壞，從而引起新一輪外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子侵入脊髓組織，形成脊髓組織炎癥損傷的惡性循環(huán)(即正反饋損傷)。因此，SCI后BSCB的破壞和反應(yīng)性炎癥損傷在脊髓繼發(fā)損傷中起著至關(guān)重要的作用[16]。

BSCB完整性與微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。緊密連接相關(guān)蛋白的缺失會(huì)造成BSCB破壞，從而增加BSCB通透性[7]。而SCI后緊密連接蛋白(ZO-1和Occludin)的脫失與SCI后炎癥反應(yīng)損傷密切相關(guān)。研究證明，SCI后致炎因子的表達(dá)與緊密連接蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[7]，過度的炎癥反應(yīng)可造成緊密連接蛋白缺失，導(dǎo)致BSCB完整性受損，血管通透性增加，外周炎性物質(zhì)滲漏入神經(jīng)組織，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致反應(yīng)性膠質(zhì)增生，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14,17-18]，導(dǎo)致髄鞘脫失和神經(jīng)元的損傷[19]。已有研究證實(shí)，SCI后小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度膠質(zhì)增生時(shí)均出現(xiàn)EGFR的過度活化[9,14]。因此，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的EGFR過度活化，可阻斷SCI的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18]，從而減輕炎癥造成的神經(jīng)毒性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中，損傷組致炎因子(IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS)明顯增高，而緊密連接蛋白(ZO-1和Occludin)明顯降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增生，脊髓組織出現(xiàn)大量髄鞘脫失，大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損，這提示SCI后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成明顯神經(jīng)損傷。而應(yīng)用奧希替尼干預(yù)后，緊密連接蛋白表達(dá)較損傷組明顯增加，而致炎因子表達(dá)較損傷組明顯減少，膠質(zhì)細(xì)胞活化增生得到抑制，并最終促進(jìn)了大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。這些結(jié)果表明奧希替尼可通過抑制EGFR活化，降低致炎因子表達(dá)，減少緊密連接蛋白缺失，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，從而減輕SCI后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終緩解了髄鞘脫失和促進(jìn)了大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，大鼠SCI后BSCB遭到破壞，導(dǎo)致外周血液中的各種炎性物質(zhì)滲出至脊髓神經(jīng)組織，引起反應(yīng)性炎癥損傷而加重脊髓繼發(fā)性損傷。EGFR抑制劑奧希替尼通過抑制EGFR活化，降低致炎因子表達(dá)，減少緊密連接蛋白缺失，抑制血脊髓屏障破壞，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，緩解了髄鞘脫失和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。