基于網(wǎng)絡藥理學的“丹參-紅花藥對”抗骨質(zhì)疏松分子機制研究*

張罡瑜， 何 琪， 林瑞婷， 溫曉雯， 楊均政，2，鐘 莎 ， 曾嘉旭， 王海彬， 陳 鵬△

廣州中醫(yī)藥大學 1第一臨床醫(yī)學院 2嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科實驗室 3第一附屬醫(yī)院關節(jié)骨科，廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨骼疾病，其特點是單位體積骨量降低，骨組織微結構退化，導致骨脆性增加而易于發(fā)生骨折[1]。OP可發(fā)生于各年齡段，以絕經(jīng)后女性及老年男性多見，隨著我國人口老齡化進展，OP發(fā)病率、醫(yī)療資源及資金投入將不斷上升。據(jù)預測，到2035年我國骨質(zhì)疏松性骨折每年發(fā)生數(shù)將達460萬例，每年經(jīng)濟負擔將增至200億美元[2]。目前西醫(yī)對OP的治療主要集中于抑制骨吸收、促進骨形成的藥物療法，但存在副作用較大、用藥時間長等局限性[3]，因此尋求更有效的中醫(yī)藥療法對防治OP具有重要意義。

丹參[4]是唇形科丹參(Salviamiltiorrhiza)的干燥根和根莖，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，常用于治療胸痹心痛、瘡瘍腫痛等病癥。現(xiàn)代藥理學研究表明[5]，丹參的主要成分是以丹酚酸B為代表的丹參總酚酸類及以丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分，其具有抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等藥理作用。紅花[4]是菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL)的干燥花，味辛，性溫，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效，常用于治療跌仆損傷、瘡瘍腫痛、瘀滯腹痛等病癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，紅花的主要成分是以羥基紅花黃色素A為代表的查爾酮類、黃酮類及生物堿類，具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、止痛、抗氧化等藥理作用[6]。丹參、紅花雖性味不同，但同有活血祛瘀、通經(jīng)止痛的功效，皆入心、肝經(jīng)，是經(jīng)典活血化瘀的相須藥對?；谒幮越M合對丹參-紅花藥對的研究表明，丹參-紅花藥對組合使用可通過參與脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、磷脂酶代謝等過程發(fā)揮活血祛瘀止痛的作用[7]。據(jù)此，丹參-紅花藥對在從瘀論治療OP方面具有較大的治療潛力和優(yōu)勢，進一步研究丹參-紅花對OP的潛在有效成分及作用機制，有助于促進丹參、紅花在OP治療上的應用，豐富OP治療選擇，提高臨床療效。

“網(wǎng)絡藥理學(network pharmacology)”概念由英國藥理學家Andrew L Hopkins教授于2007年首次提出[8]。網(wǎng)絡藥理學通過構建“藥物-基因-靶點-疾病”網(wǎng)絡關系，從網(wǎng)絡層面多層次、多角度地預測藥物的藥理學機制，揭示藥物對疾病多靶點、多通路的作用機制，有助于從整體角度論證中藥及復方中藥多成分、多途徑的治療優(yōu)勢，揭示中藥及復方中藥治療疾病的潛在活性成分及作用靶點，可見網(wǎng)絡藥理學符合中醫(yī)學的整體觀念，可為中醫(yī)藥的研究、發(fā)展提供新的思路及技術支持。

1 資料與方法

1.1 丹參、紅花化學成分信息獲取及收集

使用TCMSP平臺(version 2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集丹參、紅花兩味藥物的化學成分，對其主要化合物成分的藥物動力學(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME)性質(zhì)進行評估[9]。限制條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選出丹參、紅花中具有良好口服生物利用度和類藥性的化合物。

1.2 丹參、紅花化學成分靶點的獲取及收集

將TCMSP中篩選所得的丹參、紅花的化學成分，借助PubChem平臺(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取藥物成分的化學結構，并保存為Smiles格式。Swiss數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)可基于分子的2D和3D結構與已知配體的相似度準確地預測活性成分的靶點。在使用過程中，將物種設置為“人類”，將平臺的靶點預測結果進行收集整理。

1.3 疾病靶點的獲取及收集

Disgenet是一個綜合的基因-疾病相關關系數(shù)據(jù)庫，它結合文獻檢索和數(shù)據(jù)挖掘技術，對多種疾病進行了相關性分析，使用者可通過輸入特定基因獲取與基因相關的疾病信息，或輸入疾病名稱獲得與該疾病相關的基因[10]。通過數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“Osteoporosis”獲取與骨質(zhì)疏松相關靶標基因，最后使用Venny 2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將藥物成分相關的靶點和疾病靶點進行匹配映射，獲得丹參-紅花活性成分的作用靶點并繪制維恩圖。

1.4 藥物-活性成分-關鍵作用靶點網(wǎng)絡的構建

將丹參、紅花的活性成分所對應的靶點基因和癌癥相關的靶標基因進行匹配，獲得兩者的共同基因即為丹參-紅花治療OP的關鍵靶點。使用Cytoscape軟件(version 3.6.1，http：//www.cytosc-ape.org)構建“藥物-活性成分-關鍵作用靶點基因”關系網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中節(jié)點(node)代表丹參(DS)-紅花(HH)藥對活性成分與關鍵靶點基因；網(wǎng)絡中邊(edge)用來連接單味藥與活性成分、活性成分與關鍵靶點基因。

1.5 關鍵靶點蛋白相關作用網(wǎng)絡的構建

String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/Version 10.5)是用于預測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物學數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)是通過大量實驗檢測和生物信息學方法得到的[11]。將丹參-紅花關鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“人類”，獲得蛋白互作信息，將結果以TSV格式導出。將所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件進行可視化，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。設置網(wǎng)絡中節(jié)點大小和顏色深淺反映Degree值大小，邊的粗細反映Combine score大小。

1.6 關鍵靶點生物功能注釋及通路分析和可視化

利用Clue GO插件，對關鍵靶點進行生物過程富集分析，并根據(jù)重要程度繪制占比餅狀圖。David數(shù)據(jù)庫(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)是一個高通量生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫，能為大規(guī)模的基因或蛋白提供系統(tǒng)全面的生物學功能注釋信息，進而挖掘其生物學意義。將丹參-紅花的潛在作用靶點導入David數(shù)據(jù)庫，物種限定“人類”，對靶點進行KEGG信號通路富集分析[12]。利用omicshare平臺(http：//www.omicshare.com/)作圖。

2 結果

2.1 丹參-紅花的潛在活性成分及其分子結構

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索丹參、紅花的化合物并根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18進一步篩選，得到丹參的潛在活性成分65個，紅花潛在活性成分22個，表1列舉數(shù)據(jù)庫生成的丹參、紅花各前20位活性成分。

表1 丹參-紅花中潛在活性成分及其OB和DL值Table 1 Potential active compounds in DS-HH and the OB and DL parameters

續(xù)表1

2.2 潛在作用靶點預測

將Swiss數(shù)據(jù)庫得到的預測靶點去除重復后，得到丹參活性成分作用靶點200個，紅花活性成分靶點147個。通過檢索Disgenet數(shù)據(jù)庫得到OP疾病靶點478個。使用Venny 2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將藥物靶點和疾病靶點相映射并繪制維恩圖(圖1)，獲得共同基因36個(表2)，其中包括丹參活性成分關鍵靶點基因26個，紅花活性成分關鍵靶點基因28個，兩藥物之間共有的關鍵靶點基因為18個。這提示丹參與紅花在治療過程中既可通過單獨的靶點發(fā)揮作用，又可通過共同的作用靶點協(xié)同發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

DS：Danshen，丹參；HH：Honghua，紅花圖1 丹參-紅花靶點基因與疾病靶點基因的匹配Fig.1 Matching of target genes between DS-HH and disease

表2 關鍵靶點基因歸屬Table 2 Identification of key target genes

2.3 藥物-活性成分-關鍵作用靶點網(wǎng)絡構建與分析

將活性成分和潛在作用靶點導入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡構建及可視化(圖2)。結果表明，成分Poriferast-5-en-3beta-ol、Poriferasterol、Flavoxanthin、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Luteolin、α-amyrin、5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one、Przewalskin a、Salviolone、Phytoene、Phytofluene、Beta-carotene、Kaempferol等能與5個及5個以上的靶點相連接，可被認為是丹參-紅花治療OP的主要活性成分。連接度大于2倍中位數(shù)6的靶點基因為TERT、ESR1、ESR2、CYP19A1、ALOX15、ALOX12、STAT1，在丹參-紅花治療OP的過程中具有重要意義。

DS：丹參；HH：紅花；綠色節(jié)點代表藥物，紅色節(jié)點代表活性成分，黃色節(jié)點代表關鍵作用靶點圖2 丹參-紅花藥對活性成分、關鍵作用靶點網(wǎng)絡Fig.2 Drugs-components-targets network of active ingredients of DS-HH

2.4 關鍵靶點基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析

將丹參-紅花治療OP的36個潛在的關鍵靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)相互作用關系，再將獲得數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件繪制蛋白關系網(wǎng)絡(圖3)。節(jié)點的大小反映Degree數(shù)值大小，節(jié)點的Degree數(shù)值越大，節(jié)點越大。以節(jié)點連接之間邊的粗細反映Combine score。Combine score越大，邊越粗。其中ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6、PPARG、AR、CYP1A1、MAPK14、IGF1R、PGR、NR3C1、MMP2、STAT1、HSD17B1、CYP17A1的Degree值均大于中位數(shù)7，靶點ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6的Degree值在中位數(shù)7的2倍以上，表明這些基因在網(wǎng)絡中具有重要地位，這些靶點基因在丹參-紅花治療OP中具有重要意義，可作為丹參-紅花藥對有效成分作用的靶點基因。

圖3 丹參-紅花的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡Fig.3 Protein interaction network of DS-HH

2.5 關鍵靶點基因生物功能及通路分析

GO注釋結果顯示，丹參-紅花藥對的36個潛在關鍵靶點基因涉及Mammary gland branching involved in pregnancy(妊娠期乳腺分支，4個靶點)、Negative regulation of posttranscriptional gene silencing(轉(zhuǎn)錄后基因沉默的負調(diào)控，3個靶點)、Negative regulation of gene silencing by RNA(RNA對基因沉默的負調(diào)控，3個靶點)、Prostate gland development(前列腺生長，3個靶點)、epoxygenase P450 pathway(環(huán)氧化酶P450通路，3個靶點)、Branching involved in mammary gland duct morphogenesis(乳腺導管形態(tài)形成分支，4個靶點)等41個生物過程，表明丹參-紅花通過參與調(diào)控多種生物學過程而發(fā)揮治療OP的作用。占比餅狀圖顯示，丹參-紅花藥對治療OP主要涉及的生物過程為：Mammary gland branching involved in pregnancy(妊娠期乳腺分支，24.39%)、Negative regulation of posttranscriptional gene silencing(轉(zhuǎn)錄后基因沉默的負調(diào)控，21.95%)、Arachidonic and metabolic process(花生四烯酸代謝過程，14.63%)和Regulation of lipid catabolic process(脂質(zhì)代謝調(diào)控過程，12.20%)。見圖4。

圖4 丹參-紅花活性成分關鍵靶點的GO生物學過程富集分析Fig.4 Enriched gene ontology terms for GO biological processes of key targets from active ingredients of DS-HH

KEGG通路富集分析顯示，丹參-紅花的關鍵基因靶點主要富集的通路為Ovarian steroidogenesis(卵巢類固醇生成)、Steroid hormone biosynthesis(甾類激素生物合成)、Ptolactin signaling pathway(催乳素信號通路)、Adherens junction(粘著連接)、Bladder cancer(膀胱癌)、Estrogen signaling pathway(雌激素信號通路)等，表明丹參-紅花的活性成分靶點分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗OP作用(圖5)。

圖5 丹參-紅花活性成分關鍵靶點的KEGG通路富集分析Fig.5 Enriched KEGG pathways of key targets from main active ingredients of DS-HH

3 討論

隨著人口老齡化進展，OP發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者心理健康及生活質(zhì)量，成為我國面臨的重要公共健康問題，因此對OP治療方法的研究與探索在不斷進行。研究表明[13]，OP的中西醫(yī)結合治療比單一西醫(yī)治療可更有效地控制和改善病情。中醫(yī)學將OP歸為“骨痹”、“骨痿”等范疇，治療多遵循補益肝腎、健脾益氣、活血化瘀等治法。研究表明，血瘀是OP發(fā)病的關鍵病理基礎[14]，活血化瘀中藥對于OP的治療呈現(xiàn)出多靶點、多環(huán)節(jié)、多通路等特點[15]，具有獨特治療優(yōu)勢。實驗研究表明，丹參提取物具有促進成骨標志物基因表達、增加成骨細胞活性、誘導破骨細胞分化、改善局部微循環(huán)等作用，從而實現(xiàn)抑制骨丟失、促進骨形成、提高骨密度、降低骨質(zhì)疏松導致的骨折傾向；紅花提取物具有降低破骨細胞生成相關基因的表達、促進骨形成相關基因表達、促進骨礦化等作用，從而實現(xiàn)增加骨量，改善骨生物力學參數(shù)[16-19]。

本研究通過篩選獲得丹參-紅花藥對的潛在活性成分共87個，并在此基礎上挖掘出36個關鍵作用靶點。藥物-活性成分-關鍵作用靶點網(wǎng)絡分析顯示，Poriferast-5-en-3beta-ol、Poriferasterol、Flavoxanthin、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Luteolin、α-amyrin、5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one、Przewalskin a、Salviolone、Phytoene、Phytofluene、Beta-carotene、Kaempferol等有效成分能作用于網(wǎng)絡中的多個靶點，顯示了丹參-紅花藥對治療OP具有多成分、多靶點的作用特點。Chiou等[20]研究表明Kaempferol(山奈酚)和Luteolin(木樨草素)均可誘導雌激素受體α(ERα)磷酸化，提高Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣素、骨橋蛋白mRNA的表達，從而促進成骨細胞的分化，山奈酚還可促進成骨細胞的礦化過程。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析中，ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6在丹參-紅花藥對治療OP中起重要作用?；钚猿煞峙c靶點之間以及靶點與靶點之間的共同作用、共同調(diào)節(jié)是丹參-紅花藥對治療OP的重要作用機制。

GO注釋結果顯示，丹參-紅花的36個潛在關鍵靶點基因富集的生物學功能包括妊娠期乳腺分支、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的負調(diào)控、RNA對基因沉默的負調(diào)控、前列腺生長、環(huán)氧化酶P450途徑、乳腺導管形成的分支等。KEGG通路富集主要包括通路：卵巢類固醇生成、甾類激素生物合成、催乳素信號通路、粘著連接、膀胱癌通路、雌激素信號通路。相關的作用機制為①雌激素信號通路：生長發(fā)育和衰老過程中性激素缺乏是骨脆性發(fā)病的關鍵因素[21]。雌激素作為卵巢分泌的類固醇激素之一，可以通過雌激素受體α或者激活Wnt/β-Catenin信號通路改善人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的能力[22-23]。研究表明，17β-雌二醇(E2)通過阻斷脂聯(lián)素誘導的p38 MAPK的活化，抑制脂聯(lián)素調(diào)節(jié)的OPG/RANKL表達，進而抑制破骨細胞生成[24]。②環(huán)氧合酶途徑：花生四烯酸代謝的環(huán)氧合酶途徑可參與軟骨內(nèi)骨化的調(diào)節(jié)[25]。環(huán)氧合酶通過催化花生四烯酸的過氧化產(chǎn)生類前列腺素[26]，促進骨與軟骨代謝，在骨代謝和骨折愈合中起重要作用。③細胞色素P450途徑：細胞色素P450是肝臟混合功能氧化酶系(MFO)的主要成分。肝酶誘導劑能誘導細胞色素P450酶系統(tǒng)，使其活性增加，促使維生素D分解代謝加速最終使骨鈣入血，骨密度減低[27]。另外，研究表明細胞色素P450的亞型CYP1A1參與烴類致癌物的代謝[28]，同時丹參能誘導CYP1A1 mRNA的表達[29]，這與本研究結果顯示的丹參-紅花可作用于多個癌癥通路相似。從富集結果分析可知，丹參-紅花不僅能通過直接作用于骨代謝相關信號通路，如Wnt/β-Catenin、OPG/RANKL/RANK、MAPK信號通路，而且通過相關通路相互聯(lián)系，多靶點、多方向、多系統(tǒng)地發(fā)揮抗OP作用，這也恰恰體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的特點——治病求本、標本兼治，也進一步說明中醫(yī)多靶點、多方面進行綜合干預的可行性和優(yōu)勢。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學結果顯示丹參-紅花藥對治療OP涉及多個分子、通路和過程，成功預測了丹參和紅花對治療OP的可能機制，揭示了丹參和紅花抗骨質(zhì)疏松的多成分、多靶點、多途徑、多信號特點，為進一步的機制探討和實驗設計的優(yōu)化等提供了重要的依據(jù)。同時，本文為相關機制的研究提供了思路和方法，尤其是中藥及其復方針對某種特定疾病的機制分析，也為臨床OP治療提供了參考。