基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大復(fù)方祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

宋卓 陳悅 翟嘉威 谷珊珊 唐末 龔璐天 楊宇飛 許云

摘要 目的：大復(fù)方祛邪膠囊是基于明代醫(yī)家李中梓治療積聚的名方——陰陽攻積丸研制而成，文章通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘其對結(jié)直腸癌的作用機(jī)制，為揭示經(jīng)典名方陰陽攻積丸的臨床價值和現(xiàn)代機(jī)制提供借鑒。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥百科全書（ETCM）等數(shù)據(jù)庫篩選祛邪膠囊的活性成分及靶點(diǎn)，通過Swiss Target Prediction靶標(biāo)垂釣，取藥物靶點(diǎn)的并集。通過TTD、OMIM、Drugbank和GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)，取并集。取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，并依據(jù)化合物的Degree值篩選，建立“中藥-成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫，依據(jù)核心靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行基因本體（GO）功能和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，與前期研究結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果：構(gòu)建祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的活性成分127個，靶向254個核心基因，核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)包含248個節(jié)點(diǎn)，共有5個核心網(wǎng)絡(luò)。富集分析顯示祛邪膠囊可能主要通過調(diào)控RNA聚合酶的啟動、DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐藥、炎癥反應(yīng)等過程介導(dǎo)HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、FoxO、Toll樣受體等多個信號通路，其中凋亡、免疫方面的調(diào)節(jié)及FoxO信號通路得到本團(tuán)隊(duì)前期研究的驗(yàn)證。結(jié)論：祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制與介導(dǎo)凋亡、免疫及FoxO信號通路方面有關(guān)，此外還可能調(diào)控HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、Toll樣受體等多個信號通路，體現(xiàn)了祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌成分多、調(diào)控通路和靶點(diǎn)復(fù)雜的特點(diǎn)，同時展現(xiàn)了古人“反激逆從”和“溫陽通下”論治腫瘤的理論魅力和臨床價值，為后續(xù)的深入研究提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);大復(fù)方;祛邪膠囊;陰陽攻積丸;經(jīng)典名方;分子機(jī)制;中草藥

Abstract Objective：Dafufang Quxie Capsules are developed based on the famous prescription Yinyang Gongji Pills used by the physician LI Zhongzi in the Ming Dynasty to treat accumulation. The uses network pharmacology to explore its mechanism of action on colorectal cancer， in order to reveal the classic prescription Yin Yang Gongji Pills Provide reference for clinical value and modern mechanism. Methods：TCMSP， ETCM and other databases were searched to establish the database of active ingredients and targets of Quxie Capsules. Fishing through the Swiss Target Prediction target， we took the union of the drug targets. Through TTD， OMIM， Drugbank and GeneCards databases， we screened the targets of colorectal cancer and took the union. We took the intersection of drug target and disease target， and screened according to the degree value of the compound， established a “Chinese medicine-component-target” database， constructed a PPI network based on the core target， performed GO function and KEGG enrichment analysis， and compared the results with preliminary research. Results：The final data about Quxie Capsule for the treatment of colorectal cancer had 127 active ingredients targeting 254 core genes. The PPI network contains 248 core genes， and there were 5 subnet networks in total. Enrichment analysis results showed that Quxie Capsules may mediate HIF1α， PI3K/AKT， TNF， FoxO， Toll-like receptors through processes such as the initiation of RNA polymerase， DNA transcription， translation， protein activation and proliferation， apoptosis， drug resistance， and inflammation. And many other signaling pathways， among which the regulation of apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway have been verified by our team′s previous research. Conclusion：Mechanism of Quxie Capsules on the treatment of colorectal cancer is related to mediating apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway. In addition， it may also regulate multiple signaling pathways such as HIF1α， PI3K/AKT， TNF， and Toll-like receptors. This revealed that Quxie Capsules have many components in the treatment of colorectal cancer， and its regulatory pathways and targets are complex. At the same time， it demonstrates the theoretical charm and clinical value of the ancients′ “anti-excitement and rebellion” and “warming yang and ventilating the lower part” theory of treating tumors， providing guidance for follow-up in-depth research.

Keywords Colorectal cancer; Network pharmacology; Great prescription; Quxie Capsules; Yinyang Gongji Pills; Classic prescription; Molecular mechanism; Chinese medicinal

中圖分類號：R285;R273;R242文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.002

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）是常見的胃腸道惡性腫瘤，占全球所有癌癥病例的10%以上，對社會經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。近20年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著增長，預(yù)計(jì)2020年患病人數(shù)將達(dá)到30萬[2]。中醫(yī)藥作為獨(dú)具我國特色的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法，在多種辨治思想的指導(dǎo)下成為結(jié)直腸癌綜合治療體系中必不可少的組成部分[3]。

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院楊宇飛教授團(tuán)隊(duì)20余年來致力于結(jié)直腸癌的中西醫(yī)結(jié)合研究，在“陰瘤理論”指導(dǎo)下，挖掘古代經(jīng)典名方“陰陽攻積丸”研制出院內(nèi)制劑祛邪膠囊。祛邪膠囊主要由巴豆、吳茱萸、豬牙皂、雞內(nèi)金、生麥芽等21味中藥組成，融溫散、理氣、化痰、散結(jié)、通下為一爐，扶陽散陰或遏陽消陰，祛除體內(nèi)的致癌因素如痰毒、瘀毒、濕毒等病理產(chǎn)物，從中醫(yī)的病根上治療結(jié)直腸癌[4]。我們團(tuán)隊(duì)既往的隊(duì)列研究和隨機(jī)對照研究表明祛邪膠囊在減少Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)，延長晚期腸癌生存期，提高腸癌患者生命質(zhì)量上均有較好的療效[5-7]。基礎(chǔ)研究方面，祛邪膠囊在調(diào)節(jié)小鼠免疫和腸道微生態(tài)平衡方面也都有一定的效果[8-9]。然而，鑒于中醫(yī)理論的特殊性，祛邪膠囊配伍復(fù)雜、藥味多、活性成分雜而不明，作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)化，且部分藥物有一定的毒性，使得其組方配伍的篩選、優(yōu)化和藥效機(jī)制研究均面臨較大的困難。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network Pharmacology）基于“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”之間的復(fù)雜關(guān)系，從分子水平上闡明藥物與疾病網(wǎng)絡(luò)之間的協(xié)同效應(yīng)和潛在機(jī)制[10]。其系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)與復(fù)方的整體觀不謀而合，為大復(fù)方的深入研究提供了一個新的思路[11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，并結(jié)合前期研究結(jié)果進(jìn)行佐證，從分子水平探索大復(fù)方祛邪膠囊的體內(nèi)生物學(xué)特征，為后續(xù)的組方優(yōu)化和機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的流程圖。見圖1。

1.2 祛邪膠囊活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[12]和中醫(yī)藥百科全書（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[13]分別檢索祛邪膠囊巴豆霜、豬牙皂、吳茱萸、干姜、肉桂、川烏、黃連、半夏、橘紅、茯苓、檳榔等19味組方中藥的活性成分。TCMSP數(shù)據(jù)庫依據(jù)藥物吸收、分布、代謝、排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）特性的口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）作為篩選指標(biāo)，篩選閾值為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn);對于不符合篩選條件但既往被驗(yàn)證靶向結(jié)直腸癌的化合物及其靶點(diǎn)也納入本研究。ETCM篩選可靠性分值大于0.8的化合物及對應(yīng)靶點(diǎn)。由于雞內(nèi)金的活性成分在TCMSP、ETCM均未納入，因而通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[14]和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫[15]進(jìn)行篩選;而琥珀在上述4種數(shù)據(jù)庫均無靶點(diǎn)的記錄。同時，通過文獻(xiàn)搜索21味中藥中已被驗(yàn)證治療結(jié)直腸癌的活性成分及靶點(diǎn)完善數(shù)據(jù)。應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫[16]中的蛋白轉(zhuǎn)化功能，將TCMSP獲得的蛋白靶點(diǎn)依據(jù)物質(zhì)為“Human”、證據(jù)來源為“Reviewed”轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱。利用PubChem數(shù)據(jù)庫[17]，將所有活性化合物轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式，統(tǒng)一化合物的CAS號，應(yīng)用Swiss Target Prediction在線數(shù)據(jù)庫[18]預(yù)測篩選的所有活性化合物的可能靶點(diǎn)，擴(kuò)充其靶點(diǎn)信息。

1.3 結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)收集

以“colorectal cancer”作為檢索詞檢索GeneCards[19]、OMIM數(shù)據(jù)庫[20]、TTD數(shù)據(jù)庫[21]和Drugbank[22]4大數(shù)據(jù)庫，篩選CRC的靶點(diǎn)基因。其中，GeneCards查詢到與CRC相關(guān)的靶點(diǎn)基因較多，依據(jù)Relevance篩選出與CRC相關(guān)性較大的靶點(diǎn)基因，并將4大數(shù)據(jù)庫篩選的結(jié)果合并得到CRC疾病的靶點(diǎn)基因。

1.4 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

本研究采用Cytoscape 3.7.1[23]構(gòu)建祛邪膠囊治療CRC的“中藥-成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖展現(xiàn)其藥理關(guān)系。由于祛邪膠囊的組方大、成分多，直接構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)藥理圖會極其復(fù)雜，本研究分別依據(jù)其靶點(diǎn)和活性成分縮選，構(gòu)建準(zhǔn)確率更高的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)。首先，本研究將祛邪膠囊活性成分的靶點(diǎn)與CRC疾病的靶點(diǎn)取交集，通過交集靶點(diǎn)篩選其對應(yīng)的活性成分和中藥。其次，本研究將縮窄后得到的數(shù)據(jù)通過Cytoscape 3.7.1分析，依據(jù)Degree≥10篩選活性成分，并以此構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 3.7.1可視化處理。

1.5 靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選得到的核心靶點(diǎn)利用String數(shù)據(jù)庫[24]，依據(jù)Homo sapiens，minimum required interaction score>0.7篩選，刪除單一的靶點(diǎn)以保證網(wǎng)絡(luò)的可讀性，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1可視化處理。使用Cytoscape的MCODE功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，設(shè)置K-core值>4。

1.6 祛邪膠囊治療CRC預(yù)測靶點(diǎn)的富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫[25]對核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并限制物種為人，得到的分析結(jié)果以P<0.01進(jìn)行篩選，將所得結(jié)果與前期研究對比分析，最后通過在線網(wǎng)絡(luò)作圖工具進(jìn)行可視化處理。統(tǒng)計(jì)上述祛邪膠囊治療CRC的核心通路和相關(guān)靶點(diǎn)的信息，構(gòu)建祛邪膠囊的核心通路-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)并可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 祛邪膠囊治療CRC活性成分、靶點(diǎn)的篩選

TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫檢索到祛邪膠囊19味中藥共有活性化合物831個，靶點(diǎn)1 318個，“中藥-化合物-靶點(diǎn)”19 077組;其中BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫檢索到雞內(nèi)金含有的活性化合物3個，對應(yīng)靶點(diǎn)19個，“中藥-化合物-靶點(diǎn)”19組;祛邪膠囊的干預(yù)靶點(diǎn)匯總后共有1 329個。

GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得CRC的靶點(diǎn)8 933個，依據(jù)Relevance的中位數(shù)篩選3次得到靶點(diǎn)基因1 121個，TTD數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)基因85個，OMIM數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)基因496個，Drugbank數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)基因24個，綜合4大數(shù)據(jù)庫共獲得CRC疾病的靶點(diǎn)基因1 561個。

將祛邪膠囊活性成分的靶點(diǎn)與CRC疾病的靶點(diǎn)取交集，得到的交集靶點(diǎn)基因共282個，這些靶基因來源于祛邪膠囊中的20味中藥的642個活性化合物，得到“中藥-化合物-靶點(diǎn)”5 385組。考慮祛邪膠囊的組方較大，部分化合物僅靶向少數(shù)的靶點(diǎn)，本研究將縮窄得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1分析，并依據(jù)活性成分的Degree≥10，篩選出祛邪膠囊治療CRC可能性較大的活性成分127個。見表1，靶向254個基因，“中藥-化合物-靶點(diǎn)”3 418組，來源于19味中藥。雞內(nèi)金因其所含活性成分及靶點(diǎn)基因與結(jié)直腸癌的相關(guān)性不高而被上述過程篩掉。

2.2 祛邪膠囊治療CRC“中藥-成分-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)分析

將2.1篩選得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)模型中共有399個節(jié)點(diǎn)，3 699條連接。見圖2。該網(wǎng)絡(luò)模型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的Degree平均值約18.54，中位數(shù)12。網(wǎng)絡(luò)模型中的靶點(diǎn)均有較高的Degree值，提示這些靶點(diǎn)受祛邪膠囊多味藥的多種成分的綜合調(diào)控。本研究進(jìn)一步對各靶點(diǎn)受祛邪膠囊調(diào)控的重要程度進(jìn)行分析，靶點(diǎn)的Degree值越高表示其越可能是祛邪膠囊作用的主要靶點(diǎn)。靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的254個靶點(diǎn)有57個的Degree值≥20，有19個靶點(diǎn)的值≥36（PTGS2，PTGS1，AR，ESR1，ADH1C，ESR2，PPARG，PGR，PIK3CG，NOS3，PRSS1，AHR，TNF，RHO，PPARD，BCL2，INS，CYP1B1和PRKACA）。

2.3 祛邪膠囊治療CRC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選得到的254個核心靶點(diǎn)基因采用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，并經(jīng)Cytoscape可視化處理。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)包含248個節(jié)點(diǎn)，2 853條邊，平均Degree為23。進(jìn)一步對靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)開展MCODE子簇分析，得到5個子網(wǎng)絡(luò)。見圖3。圖中圓形表示靶點(diǎn)，靶點(diǎn)越大代表的Degree值越大，在PPI中越關(guān)鍵，線條表示靶點(diǎn)間的相互作用，作用越強(qiáng)，線條越粗。采用DAVID數(shù)據(jù)庫對子簇進(jìn)一步富集分析，發(fā)現(xiàn)這些子簇聚集的與CRC密切相關(guān)的前10條信號通路為病毒致癌作用、蛋白聚糖、細(xì)胞周期、p53信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、HIF-1α信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、Toll樣受體信號通路。

2.4 祛邪膠囊治療CRC關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對祛邪膠囊治療CRC的254個核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以P<0.01為界定值篩選。根據(jù)GO注釋結(jié)果篩選分別在分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組成（Cell Composition，CC）和生物過程（Biological Process，BP）富集中前10的條目。見圖4A。這些基因的生物過程主要涉及調(diào)控RNA聚合酶的啟動、DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐藥、炎癥反應(yīng)等方面。KEGG富集分析得到78個條目，前50個條目中與腫瘤相關(guān)的富集通路有29條，排除一些與特定腫瘤類型相關(guān)而非具體信號通路的條目，最終得到預(yù)測通路19條，并以此繪制富集通路的氣泡圖。見圖4B。富集結(jié)果顯示祛邪膠囊治療CRC核心基因主要富集的通路為HIF-1信號通路、蛋白聚糖、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、凋亡、p53信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、FoxO信號通路、VEGF信號通路、核因子κB、MAPK、Toll樣受體信號通路等。

本團(tuán)隊(duì)既往的基礎(chǔ)研究表明，祛邪膠囊能明顯抑制荷瘤小鼠結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的生長（P<0.05），其機(jī)制與增加Bim、FasL和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān);此外，祛邪膠囊能通過降低FoxO家族蛋白的表達(dá)來增加Th1細(xì)胞的數(shù)量和減少Treg細(xì)胞重塑腫瘤免疫抑制的微環(huán)境，這些結(jié)果對本研究進(jìn)行了一定程度的驗(yàn)證[8]。

進(jìn)一步將上述祛邪膠囊治療CRC的核心通路和相關(guān)靶點(diǎn)整理，構(gòu)建了祛邪膠囊的核心通路-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，圖中信號通路節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺與相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量成比例，顏色越深表明參與此通路調(diào)控的靶點(diǎn)越多。分析結(jié)果顯示祛邪膠囊治療CRC相關(guān)靶點(diǎn)參與的核心通路為PI3K-Akt信號通路、腫瘤相關(guān)的蛋白聚糖、microRNAs、Ras信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路等，調(diào)控的核心靶點(diǎn)基因?yàn)镹FKB1、AKT1、PIK3CA、PIK3CG、MAPK1、MAPK3、RELA、HRAS、IKBKB、TP53、RAF1。見圖5。

3 討論

大復(fù)方祛邪膠囊由古人治療積聚的經(jīng)典名方陰陽攻積丸研制而成，在溫通、瀉下、行氣、化痰、逐瘀的基礎(chǔ)上加了少量扶正和胃消食的中藥，共21味。陰陽攻積丸體現(xiàn)了古人針對復(fù)雜病證采用藥性相反、升降相逆中藥相激搭配的治療藝術(shù)，也體現(xiàn)了古人從“陽不化氣、陰成型”對腫瘤病機(jī)的認(rèn)識[26-27]。增加扶正和胃消食中藥后的大復(fù)方祛邪膠囊，尤為符合結(jié)直腸癌虛、痰、瘀、寒的病機(jī)特點(diǎn)，集多種治法于一爐，體現(xiàn)了配伍嚴(yán)謹(jǐn)有序、精當(dāng)貼切、機(jī)制明晰周全的中醫(yī)藥學(xué)魅力。這種大復(fù)方符合今人對腫瘤中醫(yī)病機(jī)認(rèn)識復(fù)雜性的特點(diǎn)，遵循古人“大病需用大藥”的學(xué)術(shù)思想，在惡性腫瘤防治的臨床實(shí)踐中體現(xiàn)出較好的實(shí)際意義[28]。然而這種大復(fù)方組方復(fù)雜、成分眾多，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究面臨一定的困難。亦有專家指出，多成分多靶點(diǎn)是對中藥作用機(jī)制的表面認(rèn)識，中藥作用機(jī)制實(shí)際上是藥物有效成分組成復(fù)雜物質(zhì)體系與病理?xiàng)l件下作用靶點(diǎn)組成復(fù)雜生物體系的相互作用，這意味著從單成分、單靶點(diǎn)或單信號通路去揭示大復(fù)方作用機(jī)制存在一定的問題[29]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于生物數(shù)據(jù)庫及基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，借助數(shù)學(xué)模型和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)研究方法，將藥物的作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)對接，從而建立“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)[30]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)反映了大數(shù)據(jù)時代復(fù)方中藥系統(tǒng)性研究的新趨勢，為大復(fù)方的深入研究帶來了新的思路和方法。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探討了大復(fù)方祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的分子機(jī)制。通過活性化合物和靶點(diǎn)縮選后仍獲得祛邪膠囊治療CRC的活性成分127個，靶向254個基因，來源于19味中藥，表明祛邪膠囊作用于結(jié)直腸癌的機(jī)制極其復(fù)雜。富集分析顯示祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的機(jī)制除了與本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)驗(yàn)證的免疫、凋亡生物過程和FoxO信號通路相關(guān)外，還可能與調(diào)控HIF-1、PI3K/Akt、TNF、p53、VEGF、NF-κB、MAPK、Ras、Rap1、microRNA等信號通路相關(guān)。T細(xì)胞受體、FoxO、Toll樣受體和TNF信號通路均通過調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥信號通路介導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[31-34]，部分通路介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)已得到我們前期基礎(chǔ)研究的驗(yàn)證。p53是重要的抑癌基因，參與腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移[35];Ras、Rap1是小G蛋白類的超家族成員，與MAPK在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等多種生物過程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用[36-38]，我們前期的研究也證實(shí)祛邪膠囊對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、自噬、凋亡均有一定調(diào)控作用，其機(jī)制是否與這些分子通路相關(guān)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。HIF-1是哺乳動物體內(nèi)普遍存在的缺氧應(yīng)答調(diào)控因子，參與腫瘤細(xì)胞耐受微環(huán)境和血管生成等多個生物過程的調(diào)控[39];VEGF直接參與促進(jìn)結(jié)直腸癌的血管新生過程[40];PI3K-Akt作為其下游的信號通路，參與腫瘤細(xì)胞包括增殖、分化、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、新生血管生成在內(nèi)的多個惡性生物行為[41-42]。microRNA[43]是一類進(jìn)化高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過誘導(dǎo)抑癌基因失活、調(diào)控DNA甲基化、介導(dǎo)核酸多態(tài)性的遺傳修飾、調(diào)控傳統(tǒng)信號通路等機(jī)制影響CRC的發(fā)生發(fā)展，這些機(jī)制為本團(tuán)隊(duì)后續(xù)的機(jī)制研究提供了新的思路。本研究預(yù)測的祛邪膠囊治療CRC的分子機(jī)制得到了我們前期研究的部分驗(yàn)證，二者具有較好的一致性，同時體現(xiàn)其受眾多通路的綜合調(diào)控，作用機(jī)制極其復(fù)雜。

本研究的目的是借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測大復(fù)方祛邪膠囊治療CRC的分子機(jī)制，結(jié)合前期研究結(jié)果為后續(xù)研究提供指導(dǎo)，這就要求本研究納入更全面的數(shù)據(jù)。為此，本研究篩選了比較常用的2個中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP和ETCM的活性化合物和靶點(diǎn)，依據(jù)化合物的ADME進(jìn)行篩選，對不符條件但有被證實(shí)與結(jié)直腸癌相關(guān)的化合物也納入研究。同時采用文獻(xiàn)查找的方法進(jìn)行補(bǔ)充，最終所有數(shù)據(jù)取并集。由于數(shù)據(jù)量較大，我們從化合物和靶點(diǎn)2個角度篩選最可能的化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行研究和展示。由于本研究無法考量組方劑量的配比，且忽略了化合物作用強(qiáng)弱的不同，存在無法按實(shí)際效用校正的不足，這些都是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究無法回避的問題。此外，由于中藥數(shù)據(jù)庫積累的不足，準(zhǔn)確性、不可控性以及研究方向的偏向性可能會使研究漏掉有用的活性化合物或靶點(diǎn)，制約了研究結(jié)果的可靠性，是本研究的不足。

4 結(jié)論

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測祛邪膠囊通過眾多的活性化合物和復(fù)雜的信號通路調(diào)控CRC的增殖、凋亡及腫瘤微環(huán)境乏氧、血管生成、免疫炎癥機(jī)制的調(diào)控等多個生物學(xué)過程，部分通路和生物過程得到我們前期研究的驗(yàn)證，為更深入探索祛邪膠囊治療CRC的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，展現(xiàn)了古人“反激逆從”和“溫陽通下”論治腫瘤的理論魅力和臨床價值，也為從系統(tǒng)生物學(xué)的角度研究大復(fù)方提供了借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1]Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2]Zhu J，Tan Z，Hollis-Hansen K，et al.Epidemiological trends in colorectal cancer in China：an ecological study[J].Dig Dis Sci，2017，62（1）：235-243.

[3]許云，楊宇飛.結(jié)直腸癌中醫(yī)藥研究進(jìn)展與思考[J].世界中醫(yī)藥，2014，9（7）：828-832.

[4]楊宇飛，王建彬.通陽法防治結(jié)直腸癌的理論探析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，33（5）：715-716.

[5]楊宇飛，許云，吳煜，等.祛邪膠囊減少大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床隨機(jī)雙盲對照研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（10）：879-882.

[6]楊宇飛，陳嶄新，許云，等.祛邪膠囊對晚期結(jié)直腸癌患者生存期和生活質(zhì)量的隨機(jī)對照研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28（2）：111-114.

[7]Zhang T，Yang YF，He B，et al.Efficacy and safety of quxie capsule in metastatic colorectal cancer：a double-blind randomized placebo controlled trial[J].Chin J Integr Med，2018，24（3）：171-177.

[8]Chen D，Yang Y，Yang P.Quxie capsule inhibits colon tumor growth partially through foxo1-mediated apoptosis and immune modulation[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1-12.

[9]Chen D，Yang Y，Yang P.Quxie capsule inhibits the colon tumor growth partially mediated by modulating the gut microbiome and myosin11[C].2018 Society of Integrative Oncology Annual Meeting，USA，2018.

[10]Hopkins AL.Network pharmacology：the next paradigm in drug discovery[J].Nat Chem Biol，2008，4（11）：682-690.

[11]Hao DC，Xiao PG.Network pharmacology：a rosetta stone for traditional Chinese medicine[J].Drug Dev Res，2014，75（5）：299-312.

[12]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6（1）：13.

[13]Xu HY，Zhang YQ，Liu ZM，et al.ETCM：an encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D976-D982.

[14]Liu Z，Guo F，Wang Y，et al.BATMAN-TCM：a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine[J].Sci Rep，2016，6：21146.

[15]中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所.化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫[DB/OL].http：//www.organchem.csdb.cn.[1978-2020].

[16]UniProt Consortium.UniProt：a worldwide hub of protein knowledge[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D506-D515.

[17]Kim S，Chen J，Cheng T，et al.PubChem 2019 update：improved access to chemical data[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D1102-D1109.

[18]Daina A，Michielin O，Zoete V.Swiss target prediction：updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W357-W364.

[19]Stelzer G，Rosen N，Plaschkes I，et al.The genecards suite：from gene data mining to disease genome sequence analyses[J].Curr Protoc Bioinformatics，2016，54：1.30.1-1.30.33.

[20]Hamosh A，Scott AF，Amberger JS，et al.Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），a knowledgebase of human genes and genetic disorders[J].Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：D514-517.

[21]Wang YX，Zhang S，Li FC，et al.Therapeutic target database 2020：enriched resource for facilitating research and early development of targeted therapeutics[J].Nucleic Acids Res，2020，48（D1）：D1031-D1041.

[22]Wishart DS，F(xiàn)eunang YD，Guo AC，et al.DrugBank 5.0：a major update to the DrugBank database for 2018[J].Nucleic Acids Res，2018，46（D1）：D1074-D1082.

[23]Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].Genome Res，2003，13（11）：2498-2504.

[24]Szklarczyk D，Morris JH，Cook H，et al.The STRING database in 2017：quality-controlled protein-protein association networks，made broadly accessible[J].Nucleic Acids Res，2017，45（D1）：D362-D368.

[25]Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nature Protocols，2009，4（1）：44-57.

[26]曹璐暢，許博文，李杰.基于“反激逆從”探討腫瘤病證治思路[J/OL].遼寧中醫(yī)雜志：1-11[2021-04-29].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1128.R.20201126.1754.060.html.

[27]許博文，李杰，曹璐暢，等.基于“陽化氣，陰成形”理論探討扶陽消陰法在腫瘤臨證中的應(yīng)用[J].中醫(yī)雜志，2020，61（9）：772-775，780.

[28]朱曉丹，安超，左明煥.“大方”治療惡性腫瘤淺析[J].中醫(yī)雜志，2014，55（17）：1525-1527.

[29]杜冠華，王月華，張冉，等.多成分多靶點(diǎn)是對中藥作用機(jī)制的表明認(rèn)識[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（4）：480-483.

[30]張華敏，劉思鴻，高宏杰，等.復(fù)方中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2019，19（10）：1270-1273，1276.

[31]Xiang B，Baybutt TR，Berman-Booty L，et al.Prime-boost immunization eliminates metastatic colorectal cancer by producing high-avidity effector CD8+ T Cells[J].J Immunol，2017，198（9）：3507-3514.

[32]Fu Z，Tindall DJ.FOXOs，cancer and regulation of apoptosis[J].Oncogene，2008，27（16）：2312-2319.

[33]Tsimogiannis KE，Tellis CC，Tselepis AD，et al.Toll-like receptors in the inflammatory response during open and laparoscopic colectomy for colorectal cancer[J].Surg Endosc，2012，26（2）：330-336.

[34]Chung SS，Wu Y，Okobi Q，et al.Proinflammatory Cytokines IL-6 and TNF-α Increased Telomerase Activity through NF-κB/STAT1/STAT3 Activation，and Withaferin A Inhibited the Signaling in Colorectal Cancer Cells[J].Mediators Inflamm，2017，2017：5958429.

[35]Sakanashi F，Shintani M，Tsuneyoshi M，et al.Apoptosis，necroptosis and autophagy in colorectal cancer：Associations with tumor aggressiveness and p53 status[J].Pathol Res Pract，2019，215（7）：152425.

[36]Hilbi H，Kortholt A.Role of the small GTPase Rap1 in signal transduction，cell dynamics and bacterial infection[J].Small GTPases，2019，10（5）：336-342.

[37]Militello R，Colombo MI.Small GTPases as regulators of cell division[J].Commun Integr Biol，2013，6（5）：e25460.

[38]Pranteda A，Piastra V，Stramucci L，et al.The p38 MAPK signaling activation in colorectal cancer upon therapeutic treatments[J].Int J Mol Sci，2020，21（8）：2773.

[39]Singh D，Arora R，Kaur P，et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor and metabolic pathways：possible targets of cancer[J].Cell Biosci，2017，7（13）：62-71.

[40]Bendardaf R，El-Serafi A，Syrjnen K，et al.The effect of vascular endothelial growth factor-1 expression on survival of advanced colorectal cancer patients[J].Libyan J Med，2017，12（1）：1290741.

[41]Sun Y，Zhao Y，Wang X，et al.Wogonoside prevents colitis-associated colorectal carcinogenesis and colon cancer progression in inflammation-related microenvironment via inhibiting NF-κB activation through PI3K/Akt pathway[J].Oncotarget，2016，7（23）：34300-34315.

[42]Jung KH，Choi MJ，Hong S，et al.HS-116，a novel phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor induces apoptosis and suppresses angiogenesis of hepatocellular carcinoma through inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway[J].Cancer Lett，2012，316（2）：187-195.

[43]耿帥，郭宏舉，史寧，等.微RNA對腫瘤調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志，2020，39（4）：193-197.

（2021-03-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）