基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三七-蒲黃藥對治療冠心病的作用機制

張嘉芮，徐京育

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化和(或)功能改變(如痙攣)導(dǎo)致的心肌血液供應(yīng)減少或中斷而產(chǎn)生的一組臨床癥候群。年齡、性別、吸煙、飲酒、高脂血癥、高血壓、糖尿病等均為冠心病的危險因素[1]。目前，西醫(yī)治療冠心病常用藥物為硝酸酯類、他汀類、醛固酮受體拮抗劑、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑[2]，然而這些藥物在臨床上可能會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如頭痛、眩暈、肝腎功能衰竭、心動過緩等。中藥具有對機體整體調(diào)節(jié)的功能以及較少的不良反應(yīng)[3]，可明顯改善冠心病病人預(yù)后。冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇，基本病機為心失所養(yǎng)、心脈痹阻[4]?；钛?、益氣活血為常用中醫(yī)治法。三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效，臨床上常用于冠心病、腦血管疾病、神經(jīng)癥、肺心病的治療。三七皂苷等活性物質(zhì)具有抗凝、抑制血小板聚集、促進(jìn)纖溶、擴張冠狀動脈、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用[5]。蒲黃功效為化瘀、止血、通淋，其含有黃酮類、固醇類，具有抗凝、擴張血管、改善微循環(huán)、降壓、降血脂、抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論[7]，通過“藥物-基因-靶點-疾病”之間相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響[8]，與中醫(yī)學(xué)“整體觀念”“異病同治”相似[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討三七-蒲黃藥對治療冠心病的可能分子作用機制，為中醫(yī)藥治療冠心病的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 活性成分的挖掘與篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)將三七、蒲黃兩味中藥分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化學(xué)成分分析檢測，以口服生物利用度(OB)≥30%及藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件，對化合物進(jìn)行篩選，獲得藥物活性成分及對應(yīng)靶點。

1.2 疾病靶點的查找 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)和NCBI基因數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=)進(jìn)行檢索，并刪除重復(fù)基因。NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)置為人類基因。

1.3 藥物疾病核心靶點的獲取 將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入Venny 2.1軟件制作韋恩圖，并獲取藥物及疾病共有靶點。

1.4 作用靶點的篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物疾病共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.6.0中，通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以連接度(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、平均最短路徑長度(average shortest path length)和接近中心性(closeness centrality) 4個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過degree值排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，使用R 3.6.3繪圖。

1.5 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過MCODE分析進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，打開MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析 將藥物疾病共有靶點進(jìn)行生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cell component，CC)富集。

1.7 京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，采用String數(shù)據(jù)庫，篩選三七-蒲黃藥對治療冠心病的主要作用通路。

2 結(jié) 果

2.1 三七、蒲黃活性成分與相關(guān)靶點的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索三七、蒲黃，收集其化學(xué)成分以及靶點信息，設(shè)定成分篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，對所有成分進(jìn)行篩選，三七得到7個活性成分、55個靶點；蒲黃得到8個成分、198個靶點。將兩者靶點刪除去重后，篩選出211個藥物靶點。部分三七-蒲黃藥物靶點見表1。

表1 部分三七-蒲黃藥物靶點

2.2 疾病靶點篩選 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards和NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)置為人類基因。經(jīng)過檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到6 812條相關(guān)基因，NCBI基因數(shù)據(jù)庫得到364個基因。將這兩個數(shù)據(jù)庫的基因合并去重后，得到6 812個冠心病相關(guān)基因。

2.3 藥物-疾病核心靶點獲取 將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入Venny 2.1軟件構(gòu)建韋恩圖，得到181個共有靶點。詳見圖1。

圖1 三七-蒲黃-冠心病靶點韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?將藥物-疾病共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見圖2。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.6.0中，通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯赃B接度、中介中心性、平均最短路徑長度和接近中心性4個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過連接度值排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，共篩選出66個關(guān)鍵靶點。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過MCODE分析進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，打開MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。核心靶點見圖3。共得到8個基因簇和8個核心基因，核心基因為ESR1、MYC、BCL2、CYP1B1、KCNH2、OPRM1、CHRM2、ENSG00000196689。詳見圖4。以納入的復(fù)方中藥、對應(yīng)的中藥成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建了中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖5。

圖3 核心靶點柱狀圖

圖4 核心基因

圖5 三七-蒲黃-成分-靶點-冠心病網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析 共富集到2 242條生物過程，176個分子功能，81個細(xì)胞組分。包括對脂多糖的反應(yīng)、對類固醇激素的反應(yīng)、活性氧代謝過程、核受體活動、金屬離子反應(yīng)、酮反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。使用R 3.6.3繪制氣泡圖(見圖6)和柱狀圖(見圖7)。

圖6 三七-蒲黃靶點的GO富集分析氣泡圖

圖7 三七-蒲黃靶點的GO富集分析柱狀圖

2.7 KEGG通路富集 共富集到166條信號通路。使用R 3.6.3 繪制柱狀圖(見圖8)和氣泡圖(見圖9)。

圖8 三七-蒲黃靶點的KEGG富集分析柱狀圖

圖9 三七-蒲黃靶點的KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇，《金匱要略》認(rèn)為其病機為“陽微陰弦”[10]，氣虛血瘀作為冠心病的基本病機，氣虛多因年老體衰致血液遲滯脈中，使濡潤機體的陰液不足，可見陰虛之象。氣虛不運，血滯脈中，氣機升降失司，易形成氣機郁滯。血瘀則心脈痹阻則發(fā)胸痹?！端貑枴け哉摗穂11]有“痹者，脈不通”“痹在于脈則血凝而不流”“脈者，血之府也，澀則心痛”的論述?；矢χk《針灸甲乙經(jīng)》首次明確指出瘀血可致胸膈滿痛(即胸痹)，“胸中瘀血，胸脅榰滿，膈痛”[12]。歷代醫(yī)家則提出了很多瘀血與胸痹的理論，如《繼志堂醫(yī)案》中“胸痛徹背，是名胸痹……且有血交阻隔間”；《醫(yī)學(xué)正傳》中“污血充心”；《脈因證治》中“胸痹之因，痰凝血滯是也”[13]。近代許多研究也證實了冠心病與瘀血有密切聯(lián)系，血瘀證貫穿于冠心病發(fā)生發(fā)展的全過程，故治療多以益氣活血化瘀為主。三七-蒲黃均屬活血化瘀類藥物。三七歸肝、胃經(jīng)，具有化瘀止血、消腫定痛的功效，可化瘀生新，《玉楸藥解》中指出三七可“和營止血，通脈行瘀，行淤血而斂心血”。蒲黃歸心、肝經(jīng)，可涼血止血、活血消瘀[14]。有研究表明蒲黃可抗凝、擴張血管、增加冠狀動脈血流[15]。在臨床上二者常相須為用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析三七-蒲黃藥對治療冠心病的可能分子機制。

本研究通過對三七、蒲黃有效成分的分析，構(gòu)建了藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化學(xué)成分為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2、人參皂苷f2等。其中槲皮素在網(wǎng)絡(luò)中的連接度值(126)遠(yuǎn)高于其他化學(xué)成分，由此可推斷三七-蒲黃藥對是治療冠心病中發(fā)揮療效的最關(guān)鍵成分。槲皮素是三七、蒲黃中均含有的一種黃酮類化合物[16-17]。有研究證明槲皮素具有擴張血管、降血壓、增加血流灌注、防治冠心病、抗炎、抗氧化、減輕心臟肥厚、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生肥大、防治心肌缺血再灌注損傷、抗血栓形成等多種心血管保護作用[18]。根據(jù)藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)分析示蛋白激酶B1(AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、半胱氨酸蛋白酶3基因(GASP3)等連接度值較高(>95)，是治療冠心病的關(guān)鍵作用靶點。其中AKT1是蛋白激酶B(AKT)中的一種，通過一系列下游底物來調(diào)節(jié)機體代謝、細(xì)胞存活、生長和血管生成過程[19]。AKT通過激活A(yù)S160和PFKFB2來調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪、氨基酸等物質(zhì)的代謝。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)中參與血管新生的主要調(diào)控因子，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長刺激因子，能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成[20]。IL6是一種多肽，作為重要的炎性因子，具有廣泛的生物學(xué)作用，在冠心病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。冠心病發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在局部損傷因素作用下，釋放大量IL6，促進(jìn)心血管局部斑塊發(fā)生發(fā)展，加重局部血管閉塞。有研究指出，IL6不僅可以加重疾病進(jìn)展，還能通過超敏C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)低密度脂蛋白結(jié)合，以及與單核-巨噬細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)血小板聚集，形成不穩(wěn)定斑塊[21]。本研究GO和KEGG富集分析結(jié)果主要涉及白細(xì)胞介素17(IL17)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、Th17細(xì)胞分化、C型凝集素受體信號通路。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，可引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，還能促進(jìn)炎性因子IL6的表達(dá)，參與血管平滑肌細(xì)胞的增殖分化和調(diào)控，從而使血管壁增厚、管腔狹窄、外周阻力增高，促進(jìn)高血壓形成。C型凝集素受體可識別多種病原體，與感染性疾病相關(guān)[22]。有研究表明，槲皮素等黃酮類化合物可促進(jìn)AKT1的激活，并使IL6、TNF-α活性降低。

4 小 結(jié)

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討三七-蒲黃藥對治療冠心病的多種作用靶點、作用通路及潛在機制。研究結(jié)果顯示，三七、蒲黃中的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2、人參皂苷f2等主要活性成分可能通過IL17信號通路、TNF信號通路、Th17細(xì)胞分化、C型凝集素受體信號通路作用于AKT1、IL6、VEGFA、GASP3等關(guān)鍵靶點，來發(fā)揮其抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用。希望今后能有更完善的理論、實驗和臨床研究對以上結(jié)論進(jìn)行驗證，為三七-蒲黃藥對治療冠心病提供更有效的依據(jù)。