5個(gè)抗病基因功能標(biāo)記在234份番茄材料中的檢測

陳莉菁 劉子記 謝尚潛 凌鵬 朱婕

摘? 要：番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，病害的發(fā)生和蔓延使番茄生產(chǎn)受到嚴(yán)重影響，培育多抗番茄品種是防治病害最為經(jīng)濟(jì)和有效的方法。本研究利用功能標(biāo)記對234份番茄材料進(jìn)行Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a等5個(gè)抗病基因的檢測，發(fā)現(xiàn)其中含Cf-9的番茄材料為136份，含Mi-1的材料為20份，含I-2的材料為124份，含Ph-3的材料38份，含Tm-2a的材料為24份。234份番茄材料中，不含這5個(gè)抗病基因的材料有29份;含1個(gè)抗病基因的材料有106份;含2個(gè)抗病基因的材料有70份;含3個(gè)抗病基因的材料有23份;含4個(gè)抗病基因的材料有6份，分別為11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;同時(shí)含這5個(gè)抗性基因的番茄材料尚未檢測到。該研究結(jié)果將為進(jìn)一步開展多個(gè)抗病基因的聚合育種提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番茄;功能標(biāo)記;抗病基因;聚合育種

中圖分類號：S641.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Detection of Five Disease Resistance Genes in 234 Tomato Materials with Functional Markers

CHEN Lijing1，2， LIU Ziji3， XIE Shangqian2， LING Peng2， ZHU Jie1，2

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Tomato is one of the most important vegetable crops in the world. Tomato production is seriously affected by the occurrence and spread of diseases. It is the most economical and effective way to control diseases by cultivating varieties with multiple resistant genes to different diseases. Functional markers were used to test the appearance of Cf-9， Mi-1， I-2， Ph-3 and Tm-2a genes in 234 tomato materials. Cf-9 was found in 136 materials. Mi-1 was found in 20 materials. I-2 was found in 124 materials. Ph-3 was found in 38 materials. And Tm-2a was found in 24 materials. Among the 234 tomato materials， 29 did not contain any of these five resistant genes， 106 contained one resistant gene， 70 contained two resistant genes， 23 contained three resistant genes， 6 contained four resistant genes （line 11CT387-2M， 11CHT164-2， 11CT150， 11CT271， 11CT730 and 11CT774）. None of the materials had five resistant genes. The results would lay a foundation for resistance genes pyramiding in the future.

Keywords： tomato; functional marker; resistance gene; multiple genes pyramiding

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.025

番茄（Solanum lycopersicum L.）色彩鮮艷，營養(yǎng)豐富，既可作為蔬菜，又可作為水果食用，且加工潛力較大，是世界上經(jīng)濟(jì)效益最高、栽培最廣泛的園藝作物之一。番茄是典型的設(shè)施栽培作物，極易受到設(shè)施的特殊環(huán)境、連作障礙及病害的影響。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的番茄病害達(dá)200多種，其中較嚴(yán)重的病害包括40余種，極大影響了番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。因此，選育抗病性強(qiáng)的番茄品種顯得尤為關(guān)鍵。迄今為止，在番茄中定位并克隆了一批抗病基因，包括番茄煙草花葉病毒病、葉霉病、晚疫病、枯萎病和根結(jié)線蟲病抗性基因等。

番茄葉霉病由半知菌（Cladosporium fulvum）引起。目前發(fā)現(xiàn)的葉霉病抗性基因至少有24個(gè)（Cf-1至Cf-24）。通過Ac-Ds轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆了Cf-4和Cf-9基因[2-3]，后又通過圖位克隆法獲得了Cf-2和Cf-5基因序列[4-5]。比較分析發(fā)現(xiàn)，已克隆的這幾個(gè)Cf基因均屬于LRR-TM類型，不同Cf基因亮氨酸重復(fù)數(shù)目不同，決定了對葉霉病菌不同生理小種的識別[6]。Cf基因?qū)儆诙嗷蚣易?，已克隆的Cf-4/Cf-9、Cf-2/Cf-5分別集中于番茄1號和6號染色體上，形成2個(gè)復(fù)合基因座[3， 7]。截至目前，Cf-9是利用最為廣泛的抗葉霉病基因。

根結(jié)線蟲對茄科作物的危害尤為嚴(yán)重。番茄中已定位了9個(gè)抗根結(jié)線蟲基因（Mi-1至Mi-9）。Mi-1是目前在番茄中唯一被克隆的抗根結(jié)線蟲基因。Mi-1位點(diǎn)含有同源基因Mi-1.1和Mi-1.2，其中Mi-1.1并不具有抗性，而Mi-1.2才是真正的根結(jié)線蟲抗性基因。Mi-1.2基因編碼一條含1257個(gè)氨基酸的多肽，屬于LZ-NBS-LRR類型抗性基因[8]。

番茄枯萎病由番茄尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起，致病生理小種有1號、2號和3號3種[9]。常用的番茄枯萎病抗病基因有I-1、I-2和I-3，其中I-2能兼抗1號和2號小種，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。Simons等[10]利用圖位克隆法分離I-2基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一條含1266個(gè)氨基酸的多肽，屬于NBS-LRR類型抗性基因。

目前已被鑒定的番茄晚疫病抗性基因包括Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4和Ph-5。其中Ph-3是一個(gè)部分顯性基因，對晚疫病菌的多個(gè)生理小種都具有抗性[11]。Ph-3基因已經(jīng)被轉(zhuǎn)育到優(yōu)良的栽培種中，并在生產(chǎn)實(shí)踐中表現(xiàn)出較好的抗性[12]。張春芝[11]利用圖位克隆法分離了Ph-3基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一條851個(gè)氨基酸的多肽，屬于CC-NBS-LRR類型抗性基因。

番茄花葉病毒病抗性主要由Tm-1、Tm-2和Tm-2a（Tm-22）等基因位點(diǎn)控制，其中以Tm-2a抗性最為持久[13]。Lanfermeijer等[14]利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法解析Tm-2a位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的抗病性由單基因控制，Tm-2a基因編碼一條含861個(gè)氨基酸的多肽，屬于CC-NBS-LRR類型抗性基因。

在抗病品種的培育過程中，利用傳統(tǒng)方法育種周期較長，且具有較大的盲目性。利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種，可以在苗期進(jìn)行大量的抗病性鑒定，不受時(shí)間地域限制，能顯著加速育種進(jìn)程[15]。功能分子標(biāo)記即基因特異性標(biāo)記，是基于目標(biāo)基因本身的核苷酸序列在不同個(gè)體間的差異而開發(fā)的分子標(biāo)記。相比于其他類型的分子標(biāo)記，功能標(biāo)記最大的優(yōu)點(diǎn)是與目標(biāo)基因共分離，故與目標(biāo)基因的表現(xiàn)型高度一致，是一種非常理想的分子標(biāo)記類型。

本研究將利用番茄Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a這5個(gè)抗病基因的功能分子標(biāo)記對234份番茄育種材料進(jìn)行檢測，明確不同材料含有的抗病基因情況。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究檢測的234份番茄材料中，1～37號為市售商業(yè)品種，38～234號為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的育種材料（表1）。將番茄材料盆栽于海南大學(xué)農(nóng)科樓溫室，用于基因組DNA提取及抗病基因檢測。

1.2? 方法

1.2.1? 番茄總DNA提取? 番茄種子浸種12 h后播種，25 ℃下培育30 d，待長出3～4片子葉，采用CTAB法提取總DNA[16]，?20 ℃保存。

1.2.2? 番茄抗性基因功能標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系利用番茄抗葉霉病基因Cf-9、抗根結(jié)線蟲基因Mi-1、抗枯萎病基因I-2、抗晚疫病基因Ph-3和抗煙草花葉病毒病基因Tm-2a這5個(gè)抗病基因的功能標(biāo)記開展鑒定工作，標(biāo)記具體信息見表2。5個(gè)番茄抗性基因功能標(biāo)記采用相同的PCR反應(yīng)體系和程序。25 μL PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，8 μmol/L正反向引物各2 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL和Taq DNA聚合酶1.25 U，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min，合適溫度退火1 min，72 ℃延伸80 s， 32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。其中需要用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ對根結(jié)線蟲抗性基因Mi-1的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，20 μL酶切體系包括1×TaqⅠ Buffer，5U TaqⅠ內(nèi)切酶和15 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，65 ℃酶切12 h。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 葉霉病抗性基因Cf-9檢測

Cf-9功能標(biāo)記為顯性標(biāo)記，含有Cf-9基因的番茄材料可擴(kuò)增出415 bp的條帶，不含Cf-9基因的番茄材料則無擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。經(jīng)檢測顯示，234份番茄材料中，含Cf-9抗性基因的材料有136份，其余98份不含該基因。

2.2? 根結(jié)線蟲抗性基因Mi-1檢測

Mi-1功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，所有番茄材料均能擴(kuò)增出750 bp特異性條帶，經(jīng)TaqⅠ酶切后，出現(xiàn)3種帶型（圖2）。第1種帶型含有570 bp和180 bp條帶，代表純合的Mi-1抗性位點(diǎn);第2種帶型僅包含750 bp的條帶，無法被酶切，代表該材料不含Mi-1抗性基因;第3種帶型包括750、570、180 bp 3種條帶，代表雜合的Mi-1抗性位點(diǎn)。經(jīng)檢測顯示，234份番茄材料中，含Mi-1純合抗性位點(diǎn)的材料有9份，含雜合抗性位點(diǎn)的材料有11份，不含該抗性基因的材料有214份。

2.3? 枯萎病抗性基因I-2檢測

I-2功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，可擴(kuò)增出3種帶型（圖3）。第1種帶型含有1條590 bp條帶，代表純合的I-2抗性位點(diǎn);第2種帶型含有2條640 bp條帶，代表不含I-2抗性基因;第3種帶型含有590 bp和640 bp 2個(gè)條帶，代表雜合的I-2抗性位點(diǎn)。經(jīng)檢測顯示，234份番茄材料中，含I-2純合抗性位點(diǎn)的材料有66份，含雜合抗性位點(diǎn)的材料有58份，不含該抗性基因的材料有110份。

2.4? 晚疫病抗性基因Ph-3檢測

Ph-3功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，可擴(kuò)增出3種帶型（圖4）。第1種帶型只含有1條376 bp條帶，代表純合的Ph-3抗性基因;第2種帶型則含有1條682 bp條帶，代表不含Ph-3抗性基因;第3種帶型含有376和682 bp 2個(gè)條帶，代表雜合的Ph-3抗性位點(diǎn)。經(jīng)檢測顯示，234份番茄材料中，含Ph-3純合抗性位點(diǎn)的材料有7份，含雜合抗性位點(diǎn)的材料有31份，不含該抗性基因的材料有196份。

2.5? 煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a檢測

Tm-2a功能標(biāo)記為顯性標(biāo)記，可擴(kuò)增出2種帶型（圖5）。含Tm-2a抗性基因的材料可擴(kuò)增出1條472 bp的條帶;不含該抗性基因則無擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)檢測顯示，234份番茄材料中，含Tm-2a抗性基因的材料有24份，其余210份材料不含該基因。

2.6? 5個(gè)番茄抗性基因功能標(biāo)記檢測結(jié)果

本研究檢測的234份不同類型番茄材料中，完全不含5個(gè)抗性基因的材料有29份，只含1個(gè)抗性基因的材料有106份，同時(shí)含2個(gè)抗性基因的材料有70份，含3個(gè)抗性基因的材料有24份，含4個(gè)抗性基因的材料有6份，分別為11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;尚未檢測到同時(shí)含這5個(gè)抗性基因的番茄材料（表3）。

3? 討論

番茄是全世界大宗的蔬菜作物之一，連作和設(shè)施栽培等因素加劇了病害的蔓延。聚合多個(gè)抗病基因是番茄抗病育種的重要手段。蘇曉梅[21]利用Mi-1和Ty-1功能標(biāo)記檢測83份番茄材料，發(fā)現(xiàn)其中24份材料同時(shí)含有這2個(gè)抗病基因。暴會會等[22]對32份番茄材料進(jìn)行7個(gè)抗病基因的檢測，發(fā)現(xiàn)只有9份材料含有2個(gè)抗病基因，未檢測到含有3個(gè)以上抗病基因的材料?？梢娍共』蚓酆系男什⒉惶?。本研究中，僅42%番茄材料檢測出了含2種以上的抗病基因，其中聚合3～4個(gè)抗病基因的材料僅占12%，未檢測到聚合5個(gè)抗病基因的材料。由此可見，仍需加大抗病基因聚合的力度，為培育多抗番茄品種奠定基礎(chǔ)。本研究使用的37個(gè)商業(yè)品種中，聚合3個(gè)抗病基因的材料占43%，說明番茄商業(yè)化育種進(jìn)程中，抗病基因聚合的力度正在加大，多抗育種受到了越來越高的重視。

本研究使用的234份番茄材料，從果形上看，大果類型為119份，小果類型為115份，數(shù)量相近，約各占1/2。在這2種果實(shí)類型中均以檢測到1～2個(gè)抗病基因?yàn)橹?，且大果類型中完全不含這5個(gè)抗病基因的材料略多于小果類型。從果色上看，有紅色134份、粉色36份、黃色50份、綠色5份、黑色6份、紫色3份，不同果色材料均以含1～2個(gè)抗病基因?yàn)橹?。從本研究得到的?shù)據(jù)來看，不同果形和果色的番茄材料在抗病育種上的進(jìn)展程度相對比較一致。含3～4個(gè)抗病基因的30份材料中，紅色大果為12份，占比40%，由此推斷，紅色大果相對較受市場和育種家的重視，抗病聚合育種進(jìn)展較快。

番茄抗葉霉病育種工作開展得較早。20世紀(jì)30年代初，歐美國家已普遍將葉霉病抗性基因用于商業(yè)生產(chǎn)。其中Cf-9基因在田間生產(chǎn)中對葉霉病菌多個(gè)生理小種的抑制作用均較強(qiáng)，已經(jīng)被廣泛地導(dǎo)入到栽培番茄優(yōu)良品種中[23]。王亮等[24]對218份加工番茄骨干自交系材料進(jìn)行抗病基因檢測，發(fā)現(xiàn)其中74份材料含有Cf-9基因，所占比例較大。本研究中Cf-9在不同番茄材料中的存在頻率也較高（達(dá)58%），進(jìn)一步表明Cf-9基因在番茄抗病育種中使用比較廣泛。另外，I-2基因在本研究番茄材料中存在的頻率較高，達(dá)53%。I-2基因來源于醋栗番茄（Lycopersicon pimpinelifolium），由于能兼抗番茄枯萎病1號和2號2個(gè)主要生理小種，受到育種家的普遍重視，被頻繁用于番茄枯萎病抗性育種，起到了舉足輕重的作用。本研究中的其余3個(gè)抗病基因在番茄材料中存在的頻率相對較低（Mi-1為9%;Tm-2a為10%;Ph-3為16%），在今后的育種工作中需加強(qiáng)對這些基因的選擇和應(yīng)用。

總體來說，與傳統(tǒng)育種方式相比，分子標(biāo)記輔助育種操作簡便，能加快抗病基因的聚合，提高選種育種的精準(zhǔn)性，并能適當(dāng)縮短育種年限，是一種前景廣闊的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)手段。本研究利用5個(gè)抗病基因的功能標(biāo)記對234份番茄材料進(jìn)行了檢測，篩選出的抗病材料可進(jìn)一步用于多抗聚合育種，再結(jié)合所選材料的其他優(yōu)良性狀表型，為培育多抗、優(yōu)良的番茄新品種提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[651]?? 曲文姬. 淺談番茄抗病育種研究[J]. 農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備， 2017（8）： 59.

[652]?? Jones D A， Thomas C M， Hammond-Kosack K E， et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging[J]. Science， 1994， 266（5186）： 789-793.

[653]?? Parniske M， Hammond-Kosack K E， Golstein C， et al. Novel disease resistance specificities result from sequence exchange between tandemly repeated genes at the Cf-4/Cf-9 locus of tomato[J]. Cell， 1997， 91（6）： 821-832.

[654]?? Dixon M S， Jones D A， Keddie J S， et al. The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises 2 functional genes encoding leucin-rich repeat proteins[J]. Cell， 1996， 84（3）： 451-459.

[655]?? Dixon M S， Hatzixanthis K， Jones D A， et al. The tomato Cf-5 disease resistance gene and six homologs show pronounced allelic variation in leucine-rich repeat copy number[J]. Plant Cell， 1998， 10（11）： 1915-1925.

[656]?? Joosten M， De W P. The tomato Cladosporium fulvum interaction： A versatile experimental system to study plant-pathogen interactions[J]. Annual Review of Phytopathology， 1999， 37： 335-367.

[657]?? Dickinson M J， Jones D A， Jones J D. Close linkage between the Cf-2/Cf-5 and Mi resistance loci in tomato[J]. Molecular Plant Microbe Interactions， 1993， 6（3）： 341-347.

[658]?? Milligan S B， Bodeau J， Yaghoobi J， et al. The root knot nematode resistance gene mi from tomato is a member of the leucine zipper， nucleotide binding， leucine-rich repeat family of plant genes[J]. Plant Cell， 1998， 10（8）： 1307-1319.

[659]?? Stevens M A， Rick C M. Genetics and breeding. The tomato Crop[G]. London： Chapman and Hall Ltd.， 1986： 35-109.

[660]?? Simons G， Groenendijk J， Wijbrandi J， et al. Dissection of the Fusarium I2 gene cluster in tomato reveals six homologs and one active gene copy[J]. Plant Cell， 1998， 10（6）： 1055- 1068.

[661]?? 張春芝. 番茄抗晚疫病基因Ph-3的克隆及其效應(yīng)子的篩選[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2014.

[662]? 李? 濤， Sayed R A S， 劉? 磊， 等. 番茄對晚疫病的株齡相關(guān)抗性及Ph-3的抗性機(jī)制[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2015， 42（6）： 1077-1084.

[663]?? Fraser R S S， Gerwitz A， Betti L. Deployment of resistance genes： implications from studies on resistance-breaking isolates of tobacco mosaic virus[C]//Proceedings of the Fourth International Plant Virus Epidemiology Workshop. Montpellier： ISPP， 1989： 154-155.

[664]?? Lanfermeijer F C， Dijkhuis J， Sturre M J G， et al. Cloning and characterization of the durable tomato mosaic virus resistance gene Tm-22 from Lycopersicon esculentum[J]. Plant Molecular Biology， 2003， 52（5）： 1039-1051.

[665]? 吳媛媛， 李海濤， 張子君， 等. 番茄抗晚疫病基因ph-3的RAPD和CAPS標(biāo)記[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 40（6）： 716-719.

[666]?? Fulton T M， Chunwongse J， Tanksley S D. Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants[J]. Plant Molecular Biology Report， 1995， 13（3）： 207-209.

[667]?? 孫亞林. 番茄四個(gè)抗病基因的基因標(biāo)記的創(chuàng)建與輔助選擇[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.

[668]?? 劉超勤， 李景富， 許向陽， 等. 四重PCR技術(shù)鑒定番茄Ty-1、Ty-2、Mi和Cf-5基因研究[J]. 北方園藝， 2013（9）： 119-123.

[669]?? 于拴倉， 鄒艷敏. 由基因序列開發(fā)番茄枯萎病抗性基因Ⅰ-2的共顯性分子標(biāo)記[J]. 遺傳， 2008， 30（7）： 926-932.

[670]?? 胡明瑜， 白文欽， 潘曉雪， 等. 番茄抗晚疫病基因Ph-3的分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2018， 48（4）： 560-566.

[671]?? 蘇曉梅. 番茄前景標(biāo)記和背景標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2014.

[672]?? 暴會會， 張? 杰， 趙? 凱， 等. 不同番茄親本材料7個(gè)抗性基因的分子標(biāo)記檢測[C]//中國園藝學(xué)會. 中國園藝學(xué)會2018年學(xué)術(shù)年會論文摘要集. 北京： 中國園藝學(xué)會， 2018： 155.

[673]?? De Wit P J. Cladosporium fulvum effectors： weapons in the arms race with tomato[J]. Annu Rev Phytopathol， 2016， 54： 1-23.

[674]?? 王? 亮， 董永梅， 李? 艷， 等. 加工番茄骨干自交系對葉霉病的抗性鑒定及抗病基因（Cf-9）檢測[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 29（2）： 311-315.

責(zé)任編輯：黃東杰