沉香葉黃酮穩(wěn)定性及對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞氧化損傷的保護作用

段宙位 方宗壯 何艾 王世萍 謝輝

摘? 要：研究沉香葉黃酮穩(wěn)定性及對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞氧化損傷的保護作用。通過測定溶液吸光值，探討溫度、光照、金屬離子、pH值對沉香葉黃酮穩(wěn)定性的影響。建立H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞氧化損傷模型，將細胞分為正常組、模型組以及沉香葉黃酮低、中、高劑量組，采用水溶性四唑鹽法檢測細胞增殖率，2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉法（DCFH-DA）測定細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，生化試劑盒檢測細胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、丙二醛（MDA）含量、細胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）活性。結(jié)果表明，沉香葉黃酮在溫度70 ℃以下，pH 3～7范圍內(nèi)，Na+、K+、Mg2+、Ca2+金屬離子中，黑暗環(huán)境與節(jié)能燈光中較穩(wěn)定;能顯著抑制H2O2造成的細胞死亡，降低胞內(nèi)ROS與MDA的生成，減輕LDH向細胞外擴散程度，提高SOD、CAT、GSH-Px活性。沉香葉黃酮在低溫、弱酸、部分金屬離子、弱光條件下具有一定穩(wěn)定性;對H2O2誘導(dǎo)HepG2氧化應(yīng)激損傷具有保護作用，其作用可能與調(diào)節(jié)細胞氧化還原系統(tǒng)、清除胞內(nèi)活性氧水平、提高細胞內(nèi)抗氧化酶系活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：沉香葉黃酮;穩(wěn)定性;HepG2細胞;氧化應(yīng)激

中圖分類號：R285.5????? 文獻標識碼：A

Stability and Protection Against H2O2 Induced Oxidative Stress Injury in HepG2 of Flavonoids from Aloes Leaves

DUAN Zhouwei1，2 ， FANG Zongzhuang1， HE Ai1， WANG Shiping1， XIE Hui1

1. Institute of Processing & Design of Agroproducts， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571100， China; 2. Collage of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract： The effects of temperature， light， metal ions， and pH on the stability of aloes leaves （FAL） were explored to evaluate the stability of the flavonoids from FAL and the protective effect against oxidative damage induced by H2O2 in HepG2 cells. A model of oxidative damage to HepG2 cells induced by H2O2 was established. Cells were divided into normal group， oxidative stress model group， and low-， medium- and high-dose FAL treatment groups. The cell proliferation rate was measured by the water soluble tetrazolium method （WST-1） assay. The intracellular reactive oxygen specisis （ROS） was determined by the dichloro - dihydro - fluorescein diacetate （DCFH-DA） assay. The content of lactate dehydrogenase （LDH）， the level of malondiadehycle （MDA） and the activity of superoxidedimutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and catalase （CAT） were detected by biochemical kits. The results showed that FAL were more stable under temperature 70 ℃， pH 3-7， in the Na+， K+， Mg2+， Ca2+ metal ions， in the dark environment and energy-saving lighting. FAL significantly increased the cell viability and activity of SOD， CAT and GSH-Px in cells. In addition， FAL also effectively decreased the intracellular levels of ROS and MDA， reduced the spread of LDH out of the cell. FAL had certain stability under low temperature， weak acid， some metal ions， and low light conditions. Consequently， FAL could protect HepG2 cells against H2O2-induced oxidative damage， and its underlying mechanism maight be related to regulating the cellular redox system， scavenging intracellular ROS， and increasing the activities of intracellular antioxidant enzymes.

Keywords： flavonoids from aloes leaves; stability; HepG2 cells; oxidative stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.022

過多自由基會對機體造成損傷[1]，加快炎癥、癌癥、糖尿病等疾病發(fā)展[2]。因此，國內(nèi)外越來越重視開發(fā)天然抗氧化物質(zhì)，以清除機體中過多自由基，維持其氧化動態(tài)平衡。農(nóng)產(chǎn)品被認為是“天然產(chǎn)物”的自然寶庫，從食品原料中發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)組分，安全有效地清除自由基，日益受到人們的重視。

沉香（Aquilaria agallocha Roxb.）為瑞香科沉香屬樹含黑色樹脂的木質(zhì)部，是我國名貴中藥和世界名貴香料，用于治療胃寒、腎虛、胸悶等癥狀[3]。據(jù)統(tǒng)計，2018年海南的沉香種植面積約7000 hm2，其中胸徑超過20 cm的沉香樹約2333.33 hm2，近400萬株，約占全國總數(shù)量的40%。沉香樹種植過程中產(chǎn)生大量葉子，其葉中含有多糖、黃酮等[4-5]多種活性成分，常被當作廢棄物丟棄。沉香葉黃酮具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[6-10]，如能加以利用，這對開發(fā)天然活性物質(zhì)，提高沉香附加值具有非常重要的意義。

現(xiàn)階段，開展了沉香葉黃酮提取純化[11-12]、抗氧化性[12]及結(jié)構(gòu)鑒定[13]等方面的研究。但以上研究僅采用化學(xué)試劑法測定沉香葉黃酮抗氧化性，未從細胞水平評價其抗氧化性，未對其穩(wěn)定性進行研究。進一步深入研究沉香葉黃酮的穩(wěn)定性與抗氧化性對其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用非常重要。因此，本研究探討溫度、光照、金屬離子、pH對沉香葉黃酮穩(wěn)定性的影響，建立H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討沉香葉黃酮對氧化損傷的保護作用，以期為天然抗氧化劑及功能性食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

制取沉香葉干粉。于2019年6月18日在海南省文昌市南陽鎮(zhèn)采摘沉香樹鮮葉，洗凈后50 ℃烘干，粉碎，過40目篩，制得沉香葉干粉。

胎牛血清，美國Gibco公司;過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）和丙二醛（MDA）試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

FACS Calibur型流式細胞儀，美國BD公司;FLBP-1000A型高速粉碎機，上海菲力博食品機械有限公司;C170型CO2培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司。

1.2? 方法

1.2.1? 沉香葉黃酮的制備? 將沉香葉干粉，按照纖維素酶用量200 U/g，底物濃度3 g/100mL，加入70%乙醇，在55 ℃，pH為5的條件下浸提3 h[11]，濃縮和干燥后，配成5.0 mg/mL粗提液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液，采用NKA-9樹脂動態(tài)吸附，以1.5 mL/min速度將濾液上Φ16 mm× 500 mm層析柱，用70%（V/V）乙醇以2.0 mg/mL速度洗脫，收集濾液，55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，制得沉香葉黃酮（flavonoids from aloes leaves， FAL），純度為76.58%±3.46%。

1.2.2? 黃酮溶液吸光值的測定? 采用硝酸鋁顯色法[12]測定。

1.2.3? FAL穩(wěn)定性的測定? （1）溫度對FAL穩(wěn)定性的影響。取0.05 mg/mL FAL溶液5 mL，分別置于50、60、70、80、90、100 ℃下水浴2.0 h，測定吸光值。

（2）pH對FAL穩(wěn)定性的影響。取0.05 mg/mL FAL溶液5 mL，分別用稀鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至1、3、5、7、9、11，于25 ℃下放置2 h，測定吸光值。

（3）光照對FAL穩(wěn)定性的影響。取0.05 mg/mL FAL溶液5 mL，分別置于黑暗環(huán)境、紫外燈光、節(jié)能燈光、晴朗日光環(huán)境中放置2 h，測定吸光值。其中紫外燈光與節(jié)能燈光的功率均為40 W，燈與樣品之間的距離為10 cm;晴朗日光環(huán)境光照強度為（8×104）～（10×104）lx;黑暗環(huán)境光照強度為0.001 lx。

（4）金屬離子對FAL穩(wěn)定性的影響。取0.10 mg/mL FAL溶液5 mL，分別加入5 mL 0.20 mg/mL的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+溶液，25 ℃下放置2 h，測定吸光值。

1.2.4? HepG2細胞培養(yǎng)與分組? 參照郭增旺等[14]方法。取對數(shù)期HepG2細胞分組，正常對照組：不加FAL和H2O2干預(yù)處理;模型組：不加FAL干預(yù)，加入H2O2干預(yù);實驗組：分別加入終濃度為50、100、200 ?g/mL沉香葉黃酮溶液（依次為FAL-L、FAL-M、FAL-H）干預(yù)24 h后，再加入H2O2干預(yù)。H2O2干預(yù)采用終濃度2 mmol/L的H2O2溶液作用于HepG2細胞1 h。對照組和模型組加入等量PBS溶液代替FAL。

1.2.5? 細胞存活率的測定? 參照馬萍等[15]方法。

1.2.6? 細胞內(nèi)ROS水平的測定? 參考Wang等[16]方法。

1.2.7? 細胞內(nèi)LDH、MDA水平和CAT、SOD、GSH-Px活力測定? 參考劉亭等[17]方法，按照試劑盒說明書檢測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? FAL穩(wěn)定性的測定

2.1.1? 溫度對FAL穩(wěn)定性的影響? 由圖1可知，當溫度低于70 ℃，隨著溫度升高，F(xiàn)AL溶液吸光值變化不大，說明FAL在70 ℃內(nèi)較穩(wěn)定;當溫度大于70 ℃時，隨著溫度升高，F(xiàn)AL吸光值逐漸下降，溫度越高降幅越大。由此可知，保存FAL應(yīng)避免70 ℃以上高溫。

2.1.2? pH對FAL穩(wěn)定性的影響? 由圖2可知，F(xiàn)AL溶液在pH 3～7條件下，吸光值較高;pH小于3或者大于7，吸光值均降低，說明FAL在較強酸性或者堿性環(huán)境下易受到破壞。保存FAL應(yīng)避免強酸或堿性環(huán)境。

2.1.3? 光照對FAL穩(wěn)定性的影響? 由圖3可知，不同光照條件下，F(xiàn)AL溶液吸光值：黑暗環(huán)境>節(jié)能燈光>晴朗日光>紫外燈，說明FAL在黑暗環(huán)境和節(jié)能燈光環(huán)境下具有較高穩(wěn)定性，對紫外線敏感，F(xiàn)AL應(yīng)置于棕色瓶中避光保存。

2.1.4? 金屬離子對FAL穩(wěn)定性的影響? 由表1可知，Na+、K+、Mg2+、Ca2+對FAL溶液吸光值影響較小;Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+對FAL影響較大，可能是黃酮化合物中羥基或羧基，可與某些金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，降低了吸光值。保存FAL時應(yīng)避開含有Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+的溶劑或容器。

2.2? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞存活率的影響

細胞存活率反映了細胞受外界環(huán)境損傷的程度。氧化應(yīng)激環(huán)境能對HepG2細胞造成氧化損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡[18]。由圖4可知，與正常組相比，模型組細胞存活率顯著下降，說明造模成功。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理細胞存活率達到67.82%±2.15%、75.65%±2.56%、86.56%±2.35%，與模型組相比細胞存活率顯著提高，且呈量效關(guān)系。說明FAL能夠顯著提高受損HepG2細胞存活率。

2.3? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)ROS水平的影響

正常細胞內(nèi)ROS生成和清除處于動態(tài)平衡。在外界刺激時胞內(nèi)ROS升高，高濃度ROS直接損傷細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，誘導(dǎo)細胞凋亡[19]。由圖5可知，與正常組相比，模型組中胞內(nèi)ROS水平顯著上升。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理ROS水平為6.76%±0.39%、4.85%±0.36%、1.66%± 0.15%，與模型組相比顯著降低，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著減緩損傷HepG2細胞內(nèi)ROS水平升高，減輕細胞氧化損傷。

2.4? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)LDH釋放水平的影響

LDH是糖酵解和糖異生的重要酶，廣泛分布于細胞質(zhì)中，細胞損傷時，胞內(nèi)LDH釋放到培養(yǎng)基中，其釋放水平與細胞損傷程度呈正相關(guān)，因此LDH釋放水平可反映細胞受損程度[20]。由圖6可知，與正常組相比，模型組的胞內(nèi)LDH水平顯著上升。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理LDH水平為（1241.35±102.02）、（934.45±61.98）、（555.68± 32.12）U/L，與模型組相比顯著降低，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著減少細胞內(nèi)LDH外漏，減輕細胞膜受損程度。

2.5? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)MDA含量的影響

機體自身抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)能夠抵抗外界一定程度氧化應(yīng)激刺激[21]，但當氧化應(yīng)激程度較強烈，機體抗氧化系統(tǒng)不能完全調(diào)控時，細胞就會受到氧化損傷。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成的重要代謝產(chǎn)物，其含量高低可反映細胞受自由基損傷程度[22]。由圖7可知，與正常組相比，模型組胞內(nèi)MDA濃度顯著上升。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理ROS水平為（14.18±0.65）、（11.28± 0.72）、（7.35±0.58）nmol/L，與模型組相比顯著降低，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著減輕自由基對機體的氧化應(yīng)激損傷。

2.6? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)SOD活力的影響

SOD是細胞內(nèi)源性抗氧化物酶[23]，能清除機體內(nèi)過多的ROS和MDA，其活力對細胞氧化與抗氧化平衡起著重要作用[24]，具有保護機體的作用，是抵御氧化應(yīng)激刺激的第一道防線。由圖8可知，與正常組相比，模型組組胞內(nèi)SOD活力顯著降低。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理SOD活力為（180.78±15.72）、（225.65±18.72）、（280.56±16.68）U/mg，與模型組相比顯著升高，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著提高HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷后胞內(nèi)SOD活力。

2.7? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)CAT活力的影響

CAT是內(nèi)源性抗氧化酶，能有效清除各種活性氧基團，防止其損壞細胞膜系統(tǒng)[25]。由圖9可知，與正常組相比，模型組胞內(nèi)CAT活力顯著降低。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理CAT活力為（14.78±1.12）、（21.58±1.68）、（31.56±1.58）U/mg，與模型組相比顯著升高，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著提高HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷后胞內(nèi)CAT活力。

2.8? FAL對H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)GSH-Px活力的影響

GSH-Px能催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰模℅SSG），將過氧化物還原成羥基化合物;與CAT促進H2O2分解，以保護細胞膜結(jié)構(gòu)與功能[26]。由圖10可知，與正常組相比，模型組胞內(nèi)GSH-Px活力顯著降低。經(jīng)FAL-L、FAL-M、FAL-H處理CAT活力為（23.68±1.68）、（30.78±2.12）、（42.58± 2.58）U/mg，與模型組相比顯著升高，且呈量效關(guān)系。說明FAL能顯著提高HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷后胞內(nèi)GSH-Px活力。

3? 討論

黃酮的穩(wěn)定性對其保存及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用非常重要。從溫度、pH、金屬離子、光照環(huán)境4個方面探討FAL穩(wěn)定性。結(jié)果表明，F(xiàn)AL溶液在溫度70 ℃以下，pH 3～7范圍內(nèi)，Na+、K+、Mg2+、Ca2+金屬離子中，黑暗環(huán)境與節(jié)能燈光中較穩(wěn)定。這與葛水蓮等[27]研究太行菊黃酮對溫度、pH、金屬離子、光照的穩(wěn)定性變化趨勢類似，但各指標存在差異，這可能是不同植物中黃酮的結(jié)構(gòu)與含量不同，表現(xiàn)出穩(wěn)定性差異。

氧化應(yīng)激是ROS水平和內(nèi)源性抗氧化能力之間細胞氧化還原失衡，超出自身調(diào)節(jié)范圍，引起的機體損傷。H2O2是一種重要ROS，可轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基作用于細胞引起氧化損傷[28]，常用于細胞氧化損傷研究。HepG2細胞與人正常肝實質(zhì)細胞含有同源性的生物轉(zhuǎn)化代謝酶，保留了該酶的穩(wěn)定性和完整性，廣泛用于實驗研究[29]。當機體受到氧化應(yīng)激損傷時，加速自由基和ROS形成，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成大量MDA;改變細胞膜通透性，加速細胞質(zhì)中LDH向外釋放;引發(fā)自由基鏈反應(yīng)，消耗大量SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化劑，引起細胞凋亡[21， 30]，降低細胞存活率。大量研究表明[15]，補充抗氧化成分，能夠幫助機體維持氧化動態(tài)平衡。因此，研究開發(fā)天然抗氧化物質(zhì)日益受到人們的重視。

前期研究結(jié)果表明[12]，沉香葉黃酮具有較強清除DPPH自由基、ABTS自由基能力，但未從細胞水平評價其抗氧化性，闡述其作用機制。為進一步研究沉香葉黃酮抗氧化性，本研究建立H2O2誘導(dǎo)HepG2細胞損傷模型研究FAL的保護作用。模型組中細胞存活率顯著降低，ROS、LDH、MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活力顯著下降，表明造模成功。不同質(zhì)量濃度的FAL作用于損傷的HepG2細胞時，能顯著提高HepG2細胞存活率，且其呈量效關(guān)系，說明FAL對HepG2細胞氧化損傷具有保護作用。FAL可抑制細胞中MDA和ROS生成，降低脂質(zhì)過氧化物和ROS含量，減輕LDH向外擴散程度，提高SOD、CAT、GSH-Px 3種重要內(nèi)源性抗氧化物酶活性。這與郭增旺等[14]研究小米糠黃酮保護H2O2誘導(dǎo)HepG2氧化應(yīng)激損傷時，ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px指標變化趨勢類似，但各指標存在差異。說明不同物質(zhì)提取的黃酮對氧化應(yīng)激的調(diào)控能力不同，這可能與黃酮的種類、含量，以及黃酮單體之間表現(xiàn)出協(xié)同或者拮抗作用有關(guān)。

一方面，F(xiàn)AL通過降低機體中MDA含量，減緩細胞膜系統(tǒng)氧化損傷，保持細胞結(jié)構(gòu)與功能完整性，減輕LDH向細胞外擴散程度;另一方面，通過提高細胞中SOD、CAT、GSH-Px活力，增強抗氧化系統(tǒng)防御能力，清除機體中過多ROS和MDA，保護細胞氧化損傷。由此推測，F(xiàn)AL對氧化應(yīng)激損傷細胞保護作用可能與其調(diào)節(jié)細胞氧化還原系統(tǒng)，清除胞內(nèi)ROS水平，提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性，維持細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性有關(guān)。在今后的研究中，應(yīng)從分子層面對FAL參與調(diào)控特定信號通路，保護細胞氧化應(yīng)激損傷機制方面開展深入研究。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮