咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者血漿EBV DNA和血清EB抗體與預(yù)后的關(guān)系＊

葉倩，萬鑫蕊，宗井鳳，陳巖松，崔兆磊，陳燕

[福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（福建省腫瘤醫(yī)院）1.檢驗(yàn)科，2.放療科，3.生物化學(xué)分子生物學(xué)研究室，福建 福州350014]

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是起源于頭頸部的常見惡性腫瘤，好發(fā)于東南亞和我國兩廣、福建等南方地區(qū)，其發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境、遺傳、化學(xué)等因素相關(guān)[1]。由于其解剖位置深，較難進(jìn)行早期診斷，非角化性、未分化型為主要類型，與其他頭頸部惡性腫瘤相比，NPC 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，其中咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率>70%。咽后淋巴結(jié)作為NPC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的首站，其轉(zhuǎn)移對腫瘤負(fù)荷和判斷預(yù)后有重要臨床意義，尤其對總生存率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率有較大影響，但對NPC 預(yù)后的影響尚有爭議[2]。Epstein-Barr 病毒（EBV）是常見的一種γ 皰疹病毒，與NPC 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，血漿EBV DNA 在NPC 患者療效監(jiān)測和預(yù)后評價(jià)中有重要意義，尤其是治療前后EBV DNA 濃度的變化對NPC 患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)有重要臨床意義[3]。單項(xiàng)篩查VCA-IgA敏感性高，VEA-IgA 特異性高，但易導(dǎo)致漏診和誤診的發(fā)生，故聯(lián)合檢測EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 對提高NPC 早期診斷的敏感性和特異性具有重要意義[4]。本研究回顧分析所收集病例的臨床資料和EB 病毒相關(guān)指標(biāo)，對影響NPC 預(yù)后的多種因素進(jìn)行分析，以期對臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2015年12月福建省腫瘤醫(yī)院經(jīng)鼻咽纖維鏡檢查、鼻咽病理活檢確診為NPC 的咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者139 例。其中，男性107 例，女性32 例；年齡19～75 歲，中位年齡47 歲；病理分型以非角化型鱗癌為主，占98.6%（137/139）。根據(jù)AJCC分期（第8版）[5]，初診時Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者所占比例分別為3.6%（5/139）、33.1%（46/139）、63.3%（88/139）。

1.2 標(biāo)本采集

分別抽取治療前后患者清晨空腹靜脈血8 ml。4 ml 于分離膠促凝管中，4 ml 于EDTA 抗凝管中，均室溫或2～8℃靜置30 min，以3 000 r/min 離心5min，分離得血清和血漿，標(biāo)本于-20℃冰箱冷凍待檢。

1.3 檢測方法

血漿EBV DNA 采用qRT-PCR，試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)，將待檢血漿按照EBV DNA 檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行核酸提?。?0 μl DNA 裂解液振蕩混勻，100℃干浴10 min，以13 000 r/min 離心5 min，各取2 μl 上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：93℃預(yù)變性2 min，93℃變性45 s，55℃退火及延伸60 s，共10 個循環(huán)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，隨后按如下條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：93℃變性30 s，55℃退火及延伸45 s，共30 個循環(huán)。同步擴(kuò)增試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線CT 值由儀器分析軟件自動計(jì)算各樣本病毒拷貝數(shù)，>500 copies/ml 定義為陽性，質(zhì)控品用于監(jiān)控反應(yīng)。血清EBV VCAIgA、VEA-IgA 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，試劑盒由德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司生產(chǎn)，操作方法按照說明書規(guī)范進(jìn)行，以S/CO>1.1 定義為陽性。

1.4 療效評價(jià)

患者完成治療計(jì)劃3 個月后，依據(jù)體格檢查、鼻咽鏡、核磁共振成像等結(jié)果進(jìn)行近期療效評價(jià)，依據(jù)世界衛(wèi)生組織實(shí)體瘤評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解（complete remission, CR）、部分緩解（partial remission,PR）、穩(wěn)定（stable disease, SD）和進(jìn)展（progressive disease,PD）。

1.5 隨訪

所有患者每周放療、化療期間體檢，在出院后2年內(nèi)每3 個月隨訪1 次，出院后第3～5年每半年隨訪1 次。隨訪方式為門診和電話隨訪，隨訪內(nèi)容包括完善的體檢、血液學(xué)檢查、胸片或胸部CT、腹部超聲、纖維鼻咽鏡，每半年復(fù)查鼻咽MRI，局部或頸淋巴結(jié)復(fù)發(fā)均需病理學(xué)診斷證實(shí)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本差值比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)。采用Cox 回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者治療前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA與臨床病理特征關(guān)系

139 例咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者在治療前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 的陽性檢出率分別為95.7%（133/139）、93.5%（130/139）、59.7%（83/139）。不同T 分期、N 分期和臨床分期的EBV DNA 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同臨床分期VCA-IgA 濃度和VEA-IgA 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），不同年齡、性別的EBV DNA 濃度、VCA-IgA 濃度和VEA-IgA 濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各臨床病理特征咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者治療前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平比較 M（P25，P75）

續(xù)表1

2.2 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者治療前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平的變化

咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者治療前后血漿EBV DNA 濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），治療前后VCA-IgA 濃度和VEA-IgA 濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者治療前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平比較 [n=139，M（P25，P75）]

2.3 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者治療前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 的變化與臨床療效的關(guān)系

根據(jù)治療后的臨床轉(zhuǎn)歸，將139 例患者分為緩解組（CR、PR）和進(jìn)展組（SD、PD），其中緩解組占63.31%（88/139），進(jìn)展組占36.69%（51/139）。兩組治療前后EBV DNA 差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），VCA-IgA 和VEA-IgA 差值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后EBV DNA濃度、VCA-IgA濃度和VEA-IgA濃度的差值比較 M（P25，P75）

2.4 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者生存率分析

所有患者自確診之日進(jìn)行隨訪觀察，死亡患者隨訪至死亡日，存活患者隨訪至2019年3月截止，中位隨訪時間51 個月（3～63 個月），計(jì)算患者的生存率。本研究81 例預(yù)后良好，44 例死亡，14 例失訪，失訪率為10.07%。經(jīng)MRI、CT 以及組織病理學(xué)方法證明33 例進(jìn)展，11 例局部復(fù)發(fā)，51 例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中8 例骨轉(zhuǎn)移，6 例肺轉(zhuǎn)移，4 例肝轉(zhuǎn)移，33 例多部位轉(zhuǎn)移。咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者4年總生存率為72.7%，T1期、T2期、T3期、T4期的4年總生存率分別為89.5%、80.8%、71.4%、59.6%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=43.395，P=0.000）（見圖1）。無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者4年生存率分別為87.3%和51.3%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.282，P=0.001）。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者和未遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的中位生存時間分別為32 個月和46 個月，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.318，P=0.007），遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組低于未遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（見圖2）。緩解組和進(jìn)展組4年生存率分別為85.6%和31.8%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.764，P=0.001）。緩解組和進(jìn)展組中位生存時間分別為48 個月和31 個月，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.253，P=0.003），緩解組高于進(jìn)展組（見圖3）。無復(fù)發(fā)患者和復(fù)發(fā)患者4年生存率分別為72.6%和61.9%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.573，P=0.004）。無復(fù)發(fā)患者和復(fù)發(fā)患者的中位生存時間分別為44 個月和28 個月，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.154，P=0.004），無復(fù)發(fā)患者高于復(fù)發(fā)患者（見圖4）。

圖1 不同T分期生存曲線

圖2 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存曲線

圖3 進(jìn)展生存曲線

圖4 局部復(fù)發(fā)生存曲線

2.5 咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者預(yù)后的影響因素分析

利用Cox 回歸模型對血清VCA-IgA、VEA-IgA 及EBV DNA 表達(dá)及其他臨床病理特征進(jìn)行單因素分析，結(jié)果表明：T 分期[=1.849（95% CI：1.324，3.032）]、N 分期[=1.651（95% CI：1.221，2.483）]、臨床分期[=1.672（95% CI：1.371，1.961）]、EBV DNA水平[=5.324（95% CI：3.442，7.879）]、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移側(cè)數(shù)[=1.565（95%CI：1.203，2.634）]、頸部淋巴結(jié)最大直徑[=1.976（95% CI：1.547，3.538）]及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[=1.346（95% CI：1.054，2.264）]是影響預(yù)后的主要因素（P<0.05），而性別、年齡、病理分型、分化程度、VCA-IgA 及VEA-IgA 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

表4 影響咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者預(yù)后的單因素分析參數(shù)

以生存結(jié)局為因變量，將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的T 分期、N 分期、臨床分期、EBV DNA 水平、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移側(cè)數(shù)和最大直徑以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移作為自變量，納入多因素Cox 回歸模型分析，結(jié)果表明：臨床分期[=2.162（95% CI：1.130，3.215）]、EBV DNA 水平[=2.324（95% CI：1.242，5.529）]、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移側(cè)數(shù)[=3.012（95% CI：0.653，5.564）]是影響NPC 生存率的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表5。

表5 影響咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者預(yù)后的多因素分析參數(shù)

3 討論

NPC 是我國南方地區(qū)高發(fā)的常見頭頸部惡性腫瘤，隨著醫(yī)療水平的提高，NPC 的5年生存率有較大的進(jìn)展，但仍有60%～80%[6]，NPC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，而咽后淋巴結(jié)是NPC 轉(zhuǎn)移的首站淋巴結(jié)，是判斷NPC 的預(yù)后和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的重要影響因素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)入組患者EBV DNA 比VCA-IgA 和VEA-IgA 陽性率高，且VCA-IgA 較VEA-IgA 高，T分期、N 分期和臨床分期越大，EBV DNA 的拷貝數(shù)越高，與CHAN 等[8]報(bào)道一致。杜云等[9]報(bào)告VCAIgA、VEA-IgA 抗體水平隨著臨床分期的增大而升高，與本研究結(jié)果一致。

對治療前后分析發(fā)現(xiàn)，治療后EBV DNA 濃度顯著下降，VCA-IgA、VEA-IgA 抗體水平無差，表明EBV DNA 對療效觀察更加敏感且優(yōu)于VCA-IgA、VEA-IgA，大部分NPC 患者治療后血清中仍然有較高滴度的抗體，可能與其在血清中的半衰期較長有關(guān)，與李仕偉等[10]報(bào)道相似。緩解組和進(jìn)展組EBV DNA 治療前后對數(shù)值差值比較有差異，而VCA-IgA、VEA-IgA 治療前后差值比較無差異，提示EBV DNA 對腫瘤負(fù)荷、近期療效評估有重要意義，與陳巖松等[11]和令狐穎等[12]報(bào)道一致，同時也進(jìn)一步說明EBV DNA 對于療效評估優(yōu)于VCA-IgA、VEA-IgA。

本研究預(yù)后因素分析提示EBV DNA 與患者生存時間相關(guān)，與CHEN 等[13]的研究結(jié)果相似，而VCA-IgA、VEA-IgA 與患者的生存時間無明顯相關(guān)，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[14-15]。EBV DNA 比VCA-IgA、VEA-IgA 更適用于NPC 患者的預(yù)后判斷，可能與VCA-IgA、VEA-IgA 在血清中高滴度持續(xù)時間長有關(guān)。陳賢明等[16]報(bào)告不同性別的生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果一致。對年齡單因素分析提示年輕患者的生存率比老年患者高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與老年病人存在基礎(chǔ)病、免疫力低下、對放療或化療的耐受能力差有關(guān)，不同于HE 等[17]研究結(jié)果。

宗井鳳[18]報(bào)告T 分期是NPC 預(yù)后的一個重要因素，且隨著T 分期越高腫瘤的預(yù)后也更差，有學(xué)者報(bào)道N 分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位、頸部淋巴結(jié)側(cè)數(shù)和頸部淋巴結(jié)最大直徑是NPC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后的危險(xiǎn)因素[19-20]，與本研究結(jié)果相似。劉波等[21]和HUANG 等[22]提出NPC 患者咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響N 分期的重要因素，與NPC 預(yù)后和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本文發(fā)現(xiàn)咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者N 分期較大，預(yù)后也較差。

綜上所述，EBV DNA 對NPC 患者有重要臨床意義，動態(tài)觀察三項(xiàng)指標(biāo)水平對于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯的預(yù)測作用，其中EBV DNA 載量變化較VCA-IgA、VEA-IgA 水平變化更敏感，療效和預(yù)后監(jiān)測價(jià)值優(yōu)于VCA-IgA、VEA-IgA，探討預(yù)后影響因素對NPC 的治療和提高生存率具有重要意義，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可為咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC患者的療效監(jiān)測、預(yù)后判斷和個體化治療提供幫助。