烏靈膠囊對卒中后抑郁大鼠海馬P13K/Akt/mTOR通路和神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

孫微，王一帆，李賀，劉影

（1.深圳市薩米醫(yī)療中心，廣東 深圳518118；2.北華大學(xué)，吉林 吉林132013；3.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院，上海201600）

卒中后抑郁是最常見的一種卒中相關(guān)情緒障礙，主要是指在腦卒中后發(fā)生的由多種復(fù)雜因素導(dǎo)致的一種情感障礙性疾病[1-2]。臨床調(diào)查顯示，卒中后抑郁發(fā)病率呈不斷上升趨勢，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量[3]。卒中后抑郁不僅直接影響神經(jīng)功能，而且會增加腦卒中的致殘率及病死率，給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)[4]。卒中后抑郁具體發(fā)病機制較為復(fù)雜，其中神經(jīng)遞質(zhì)在卒中后抑郁中發(fā)揮重要作用，認為神經(jīng)遞質(zhì)與記憶、睡眠及情感等密切相關(guān)，其功能或水平下降，是抑郁癥發(fā)病的生物學(xué)基礎(chǔ)[5]。近年來中醫(yī)藥在卒中后抑郁方面有較大進展，且獲得良好效果，烏靈膠囊是一種中成藥，具有養(yǎng)心安神、清心化痰、補腎健腦功效，用于抑郁癥方面獲得良好效果[6]。因此，本文研究通過探討烏靈膠囊對卒中后抑郁大鼠海馬P13K/Akt/mTOR 通路和神經(jīng)遞質(zhì)的影響，為治療卒中后抑郁及其相關(guān)作用機制的研究提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物

健康SD 大鼠48 只，體重（200±20）g，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲食飲水。SD 大鼠購自中國中醫(yī)科學(xué)院實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK2018-0001，動物使用許可證號：SYXK2018-0001。烏靈膠囊購自浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.33 g，國藥準(zhǔn)字Z19990048。

1.2 主要試劑

大鼠去甲腎上腺素（Norepinephrine, NE）和多巴胺（Dopamine, DA）試劑盒購自北京博蕾德生物科技有限公司，大鼠5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）購自北京博蕾德生物科技有限公司，P13K 抗體、p-Akt 抗體、p-mTOR 抗體購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 卒中后抑郁模型的復(fù)制采用改良Zea-Longa 法復(fù)制大腦中動脈缺血大鼠模型（MCAO 模型），具體方法：術(shù)前大鼠禁水、禁食24 h，腹腔注射0.35 ml/100 g 的8%水合氯醛麻醉，大鼠麻醉成功后取仰臥位，將其固定于操作臺，常規(guī)備皮消毒，沿大鼠頸正中行1.5～2.0 cm 縱行切口，切口處皮下組織采用鈍行分離，沿大鼠右側(cè)頸前肌群和胸鎖乳突肌間分離右側(cè)頸內(nèi)動脈（internal carotid artery,ICA）、頸外動脈（external carotid artery, ECA）和頸總動脈（common carotid artery, CCA），分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處的迷走神經(jīng)。ICA 和CCA 采用微動脈夾暫時夾閉，在ICA 近心端置一根絲線，再于ECA 和CCA 分叉3 mm 處剪開一小口，再取魚線插入ICA 且輕推，最后將微動脈夾取掉。手術(shù)完成后逐層縫合并消毒，術(shù)后大鼠腹腔注射40 000 u/（次·d）青霉素，共3 d，以預(yù)防電解質(zhì)紊亂和感染。模型復(fù)制成功后于第2 天大鼠單籠飼養(yǎng)，皮下注射利血平復(fù)制卒中后抑郁模型，4 mg/kg，1 次/d，連續(xù)15 d；對照組等量皮下注射相同天數(shù)的生理鹽水。

1.3.2 實驗分組及干預(yù)方法48 只大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組12 只，雌雄各6 只。對照組和模型組予以等劑量雙蒸水灌胃；低劑量組于模型復(fù)制成功后第2 天開始將40 mg 烏靈膠囊溶于1 ml 雙蒸水灌胃，1 次/d；高劑量組于模型復(fù)制成功后第2 天開始將80 mg 烏靈膠囊溶于1 ml 雙蒸水灌胃，1 次/d。各組大鼠灌胃21 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)檢測采用大鼠Zea Longa 神經(jīng)行為學(xué)評分：無任何神經(jīng)功能缺損癥狀為0 分（無缺損）；抓取尾部提拎大鼠離開地面，大鼠前爪無法完全伸展為1 分（輕度缺損）；大鼠左前肢肌力減弱，及大鼠行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2 分（中度缺損）；大鼠向左側(cè)傾倒或無法行走為3 分（重度缺損）；大鼠意識喪失昏迷為4 分（無神經(jīng)功能）。評分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.2 Western blotting 檢測大鼠海馬組織海馬組織PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量采用RIPA 裂解液勻漿提取總蛋白，蛋白定量測定采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒。聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，加入5%脫脂奶粉，置于室溫條件下封閉1 h。采用TBST 溶液洗滌3 次，8 min/次，分別加入PI3K（1∶200）、p-Akt（1∶500）、p-mTOR一抗（1∶1 000）及GAPDH（1∶3 000），4℃條件下孵育過夜。采用TBST溶液洗脫3次，10 min/次，加入IgG 二抗（1∶3 000）室溫條件下孵育1 h，再以TBST 溶液洗滌3 次，8 min/次。ECL 化學(xué)發(fā)光試 劑盒處理后凝膠成像儀顯影，采用Image Lab 圖像處理軟件分析條帶灰度值。

1.4.3 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測取大鼠腦組織，快速剪取右側(cè)海馬組織，稱重大鼠海馬組織后放置于液氮速凍，置入-80℃冰箱冷凍保存待測。取海馬組織加入二羥基苯甲酸，于冰浴上超聲勻漿30 s，半徑15 cm，15 000 r/min 離心12 min，取上清液，采用高效液相色譜法測定海馬組織NE、DA 和5-HT 含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)組織病理損傷程度

對照組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量豐富，并且細胞形態(tài)規(guī)則染色均一，胞質(zhì)豐富清亮；模型組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，且腦組織結(jié)構(gòu)松散，細胞染色淺及排列紊亂不對稱；低劑量組和高劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較模型組增加，且腦組織結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，細胞數(shù)量較模型組增加。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)組織病理損傷程度 （HE染色×200）

2.2 各組大鼠Zea Longa評分比較

對照組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠Zea Longa 評分分別為（0.00±0.00）分、（2.70±0.43）分、（2.04±0.2）分和（1.12±0.26）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=68.511，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、低劑量組和高劑量組高于對照組（P<0.05）；低劑量組和高劑量組低于模型組（P<0.05）；高劑量組低于低劑量組（P<0.05）。

2.3 各組大鼠海馬組織PI3K、p-Akt 和p-mTOR蛋白相對表達量比較

對照組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠海馬組織PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、低劑量組和高劑量組低于對照組（P<0.05）；低劑量組和高劑量組高于模型組（P<0.05）；高劑量組高于低劑量組（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠海馬組織PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表相對表達量比較 （n=12，±s）

表1 各組大鼠海馬組織PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表相對表達量比較 （n=12，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與低劑量組比較，P<0.05。

組別p-mTOR蛋白PI3K蛋白p-Akt蛋白對照組模型組低劑量組高劑量組F 值P 值1.23±0.32 0.45±0.14①0.79±0.11①②0.97±0.16①②③43.812 0.000 0.94±0.15 0.25±0.07①0.52±0.10①②0.71±0.13①②③60.491 0.000 1.53±0.28 0.59±0.13①0.84±0.18①②1.17±0.15①②③8.502 0.000

2.4 各組大鼠海馬組織NE、DA和5-HT含量比較

對照組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠海馬組織NE、DA 和5-HT 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、低劑量組和高劑量組NE、DA 和5-HT 含量低于對照組（P<0.05）；低劑量組和高劑量組NE、DA 和5-HT 含量高于模型組（P<0.05）；高劑量組NE、DA 含量高于低劑量組（P<0.05）；高劑量組5-HT 含量低于低劑量組（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織NE、DA和5-HT含量比較（n=12，ng/ml，±s）

表2 各組大鼠海馬組織NE、DA和5-HT含量比較（n=12，ng/ml，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與低劑量組比較，P<0.05。

5-HT 組別NE DA 197.45±24.31 103.21±17.87①165.42±20.98①②130.34±26.56①②③23.906 0.000對照組模型組低劑量組高劑量組F 值P 值95.42±13.24 47.83±7.86①59.98±10.10①②78.54±15.42①②③21.444 0.000 413.24±46.56 243.12±30.28①308.29±25.45①②365.21±34.29①②③49.029 0.000

3 討論

卒中后抑郁發(fā)病機制較為復(fù)雜，尚未完全闡明，主要指腦卒中后發(fā)生的抑郁狀態(tài)，相比于普通抑郁癥，卒中后抑郁幾乎均有神經(jīng)功能缺損體征，且患者日常生活能力明顯下降，給生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響，故而卒中后抑郁引起廣泛關(guān)注[7-11]。烏靈膠囊主要由單一成分烏靈菌粉構(gòu)成，從真菌烏靈參中分離獲得的菌種。烏靈膠囊成分包括含賴氨酸、GABA、Glu、Asp 等多種氨基酸，以及微量元素、鳥苷、腺嘌呤、腺苷等[12-13]。現(xiàn)代藥理研究表明，烏靈膠囊可促進GABA 和Glu 進入腦內(nèi)，激活GABA 受體[14-16]。本研究結(jié)果表明，低劑量組和高劑量組大鼠Zea Longa 評分低于模型組，提示烏靈膠囊可改善卒中后抑郁大鼠行為。

細胞自噬主要是對包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響。LC3 是重要的自噬標(biāo)記蛋白，Beclin1 是自噬活化的一種關(guān)鍵因子，自噬形成時LC3B-I 會降解一小段多肽轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B-Ⅱ，而其中LC3B-Ⅱ/Ⅰ能夠衡量細胞自噬水平。而其中mTOR 是自噬發(fā)生的抑制性激酶之一，其激活后能夠抑制細胞自噬。PI3K/Akt/mTOR 是自噬關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，卒中后抑郁模型大鼠PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量降低，而給予烏靈膠囊可上調(diào)PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表達，但其具體作用機制尚未完全明確，還需后續(xù)增加樣本量進一步研究。

大腦皮質(zhì)與人的高級神經(jīng)活動、抽象思維及情緒相關(guān)，是腦內(nèi)重要的一種情感整合中樞。“海馬區(qū)”是大腦皮質(zhì)的一個內(nèi)褶區(qū)，在許多病理解剖學(xué)和結(jié)構(gòu)影像學(xué)中發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者以海馬區(qū)為主的邊緣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)體積萎縮、神經(jīng)減退等病理現(xiàn)象。海馬區(qū)的功能在抑郁癥發(fā)病過程中嚴(yán)重減退，甚者可發(fā)生體積明顯縮小。卒中后抑郁發(fā)病與社會心理因素、環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)，原發(fā)性內(nèi)源性學(xué)說是其重要的發(fā)病機制。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中損害干擾神經(jīng)透射，造成單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括NE、5-HT 含量變化及功能缺陷，導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生。抑郁癥存在前額皮質(zhì)體積減小，而前皮質(zhì)改變與抑郁癥發(fā)生有關(guān)[17-18]。NE 和5-HT都有神經(jīng)纖維上行透射至海馬，NE 和5-HT 能神經(jīng)元胞體位于皮質(zhì)，可影響區(qū)域內(nèi)NE 和5-HT 的神經(jīng)通路，使海馬區(qū)NE 和5-HT 含量下降而造成抑郁。本研究結(jié)果表明，低劑量組和高劑量組大鼠海馬組織NE、DA 和5-HT 含量高于模型組，提示烏靈膠囊可通過上調(diào)海馬組織NE、DA 和5-HT 含量而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平。在今后的工作中，需進一步探討單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)元損傷及卒中后抑郁行為改變的關(guān)系，深入闡明烏靈膠囊治療卒中后抑郁的作用機制。

綜上所述，烏靈膠囊可改善卒中后抑郁大鼠行為，且可調(diào)節(jié)海馬P13K/Akt/mTOR 通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平。