規(guī)模養(yǎng)雞場分離的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)

王會生,高紅麗,張 輝 ,薛 平,韓慶彥,*

(1.禮縣畜牧獸醫(yī)站，甘肅 禮縣742200；2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心)

規(guī)模養(yǎng)雞生產(chǎn)中，曾一度大量使用乃至濫用抗菌藥物，為了解細(xì)菌對抗菌藥物的耐受情況，筆者進(jìn)行了規(guī)模養(yǎng)雞場雞舍環(huán)境及腸道細(xì)菌對15種抗菌藥物的抑菌實(shí)驗(yàn)，從而為雞病防治中減少抗菌藥物的使用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

通過在環(huán)境和機(jī)體采取樣品，在普通肉湯和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離出大腸桿菌，再在普通瓊脂培養(yǎng)基上，對15種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；在普通肉湯和瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離出金黃色葡萄球菌，在普通瓊脂培養(yǎng)基上分別進(jìn)行15種抗菌藥物對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)。從而掌握規(guī)模養(yǎng)雞場環(huán)境及其雞群寄生的細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性。

1.1 樣品采集

采樣雞場的選擇和抗生素使用情況 共隨機(jī)選擇了兩個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的5個存欄1萬只以上的規(guī)模養(yǎng)雞場，有關(guān)情況見表1。

表1 規(guī)模養(yǎng)雞場有關(guān)情況

環(huán)境采樣 采樣前用滅菌生理鹽水將滅菌棉簽浸濕，在采樣場雞舍內(nèi)水槽、料槽以及墻壁處隨機(jī)采樣，在采樣點(diǎn)充分擦拭，每個點(diǎn)各采樣3份共采集9份環(huán)境樣品，5個養(yǎng)雞場共采樣45份。采集樣品裝入滅菌小試管，1h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測。

雞口腔泄殖腔采樣 在上述采樣時，每個雞場隨機(jī)選取3只雞，分別采取口腔和泄殖腔棉拭子，每場采集6份樣品，裝入小試管送檢。5個養(yǎng)雞場共計采樣30份樣品。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將以上75份樣品，分別接種肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌增值培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h，然后分別劃線接種麥康凱瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，再進(jìn)行37℃24h培養(yǎng)，普通瓊脂上如果菌落生長不好，可以延長培養(yǎng)6～12 h。

1.3 細(xì)菌初步鑒定

大腸桿菌初步鑒定 在麥康凱培養(yǎng)基上挑選粉紅色光滑邊緣整齊的單個菌落，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，并挑選相同菌落接種葡萄糖發(fā)酵管進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，37℃培養(yǎng)48 h，產(chǎn)生輕微氣體、變黃；刺種三糖鐵培養(yǎng)，37℃24 h培養(yǎng)，看到底部變黃有黑色沉淀；接種蛋白胨水， 37℃培養(yǎng)48 h，再加入吲哚試劑，出現(xiàn)紅色者。經(jīng)過以上三個生化試驗(yàn)可鑒定為大腸桿菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

金黃色葡萄球菌初步鑒定 環(huán)境樣品在普通瓊脂上挑選露滴狀邊緣整齊金黃色菌落，采用革蘭氏染色鏡檢，呈革蘭氏陽性葡萄串樣者，初步鑒定金黃色葡萄球菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 藥敏試驗(yàn)

1.4.1 材料 15種藥敏試紙執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS/T125-1999，藥物含量30μg/片。其中土霉素藥敏試紙由上海綠盟有限公司出品，其余14種藥敏試紙由杭州生物制劑有限公司出品，批號見表2。常規(guī)法制作9cm普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等培養(yǎng)基若干。數(shù)顯游標(biāo)卡尺一把。

表2 15種抗菌藥物藥敏試紙生產(chǎn)批號

抗菌藥物判定標(biāo)準(zhǔn)，抑菌環(huán)直徑≥4.5mm為高度敏感，2～4.5 mm為中度敏感，1～2 mm為輕度敏感，≤1 mm為耐藥。

1.4.2 藥敏試驗(yàn) 將初步鑒定的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種到9 cm普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，同時將藥敏試紙用無菌眼科手術(shù)鑷小心夾放在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量試紙周圍抑菌環(huán)直徑并登記。

2 結(jié)果

2.1 45份環(huán)境樣品、30份消化道樣品大腸桿菌藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)的平均值見表3

表3 15種抗菌藥物對于大腸桿菌抑菌環(huán)的平均值 mm

2.2 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)的抑菌環(huán)平均值

在口腔和泄殖腔樣品中培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌菌株少，75份樣品中金黃色葡萄球菌檢出菌株數(shù)如表4。

表4 五個規(guī)模場環(huán)境檢出金黃色葡萄球菌菌株數(shù)

15種抗菌藥物對于金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)平均值見表5。

表5 15種抗菌藥物對于金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)平均值 mm

2.3 各規(guī)模養(yǎng)殖場之間大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表6和表7

表6 15種抗菌藥物對五個規(guī)模場飼槽環(huán)境大腸桿菌抑菌環(huán)平均值 mm

場1由于養(yǎng)殖時間較短，其環(huán)境內(nèi)樣品培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的敏感性較其余四個養(yǎng)殖場較強(qiáng)，而場2養(yǎng)殖時間雖比其余三個場多兩年，但區(qū)別并不明顯。以飼槽采樣的大腸桿菌為例，場1的15種抗生素抑菌環(huán)直徑平均值為 3.66 mm，比其余四個規(guī)模場的平均數(shù)3.03 mm、3.09 mm、3.23 mm、2.90 mm顯著高，而五個場的抑菌環(huán)平均值為3.18 mm，顯示規(guī)模場飼養(yǎng)的時間越長，其場內(nèi)環(huán)境細(xì)菌的耐藥性就越強(qiáng)。

而在五個飼養(yǎng)場內(nèi)雞腸道采樣的細(xì)菌來說(見表7)，其五個規(guī)模場的15種常見抗菌藥物的抑菌環(huán)分別為2.64 mm、2.47 mm、2.30 mm、2.57 mm、2.57 mm，五個場的平均值為2.51 mm，平均值差異不大，顯示規(guī)模場飼養(yǎng)時間長短、雞群的飼養(yǎng)方式等對于雞的腸道細(xì)菌耐藥性的影響不顯著。

表7 15種抗菌藥物對泄殖腔腸道大腸桿菌抑菌環(huán)平均值 mm

3 討論

3.1 藥物敏感性

對于大腸桿菌，慶大霉素、妥布霉素、頭孢拉定、頭孢曲松、卡拉霉素、林可霉素的抑菌效果比較敏感，紅霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林的抗菌效果次之，而土霉素、青霉素、頭孢唑啉、頭孢氨芐、磺胺異噁唑等的抗菌效果很差，其耐藥性很強(qiáng)。尤其是土霉素和磺胺異噁唑的抗菌效果接近于零。

對于葡萄球菌，氟苯尼考、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢曲松、卡拉霉素的抑菌效果較好，敏感性強(qiáng)，而青霉素、氨芐西林、紅霉素、林可霉素的抗菌效果次之，土霉素、慶大霉素、妥布霉素、恩諾沙星、磺胺異噁唑等的抗菌效果很差，尤其是土霉素和磺胺異噁唑的抗菌效果接近于零。

3.2 結(jié)合養(yǎng)殖及用藥調(diào)查情況分析

各規(guī)模場環(huán)境樣品和雞腸道樣品分離細(xì)菌對不同抗菌素的敏感性分析，規(guī)模養(yǎng)雞場對于土霉素、青霉素、磺胺類的使用是普遍和長期的，且環(huán)境中有一定殘留。在表3的數(shù)據(jù)里，可以看出五個規(guī)模場的藥敏試驗(yàn)結(jié)果明顯地顯示，在雞群口腔和泄殖腔分離的大腸桿菌抑菌環(huán)更小，一般來說接近或小于平均值；而在環(huán)境里分離出的大腸桿菌的培養(yǎng)基上的抑菌環(huán)就相對大一點(diǎn)，一般來說大于或等于平均值。這個情況在表6和表7即五個規(guī)模場的飼槽和同時在雞泄殖腔采樣的大腸桿菌的抑菌環(huán)大小上也是同樣的，其飼槽平均的抑菌環(huán)為3.18 mm，而泄殖腔平均的抑菌環(huán)為2.57 mm，說明雞體內(nèi)腸道細(xì)菌耐藥性更強(qiáng)。

前幾年，這些雞場多采取7日齡前后在飲水中添加10%阿莫西林可溶性粉，15～19日齡飼料中添加10%多西環(huán)素，成年后在飼料中添加替米考星、土霉素或泰樂菌素等用藥程序；目前由于國家市場監(jiān)管部門對肉、蛋進(jìn)行藥物殘留檢測，一旦發(fā)現(xiàn)有殘留則將該雞場列入黑名單，尤其對給農(nóng)村中小學(xué)生供應(yīng)雞蛋的養(yǎng)殖場監(jiān)測更為嚴(yán)格。不排除會有個別不法養(yǎng)雞場戶在早期使用抗生素，調(diào)查中場主雖然沒有承認(rèn)，但以上藥敏試驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面反映了這個問題。

3.3 中西醫(yī)結(jié)合防治

規(guī)模養(yǎng)雞疫病防治中，雖然已經(jīng)開始減少抗生素應(yīng)用，但環(huán)境中依舊存在有一定的耐藥性細(xì)菌，要穩(wěn)定降低細(xì)菌耐藥性，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖任重而道遠(yuǎn)。目前要積極引導(dǎo)幫助規(guī)模養(yǎng)雞場改變用藥，盡量使用抑菌效果較好的抗菌藥物，精準(zhǔn)用藥減少對一些抑菌效果較差藥物的使用非常重要。同事要采用中草藥如雙黃連、麻杏石甘湯、白頭翁等方藥和其他中藥的各種劑型，微生態(tài)制劑、酸制劑、植物精油等的使用，結(jié)合生物安全等減抗雞病防治技術(shù)，是必由之路。