循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞對尿路上皮癌預(yù)后的預(yù)測價值*

劉杰 李小航 李安安 劉昕 苗岳松 王志勇

尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC）作為最常見的惡性腫瘤，在中國泌尿系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率及死亡率均位于前列[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的TNM 分期、分級以及血小板與白蛋白比值均有助于預(yù)測UC 患者的預(yù)后[2-3]，但這些預(yù)測指標(biāo)存在易受臨床因素干擾的缺陷。因此，需進(jìn)一步納入其他因素對患者的預(yù)后進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）和循環(huán)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞（circulating tumor-derived endothelial cell，CTEC）起著不可或缺的作用[4]，而CTEC 對預(yù)測UC 患者的預(yù)后價值有待進(jìn)一步證實。本研究旨在通過分析外周血中CTC 和CTEC 與UC 患者預(yù)后關(guān)系，為臨床預(yù)測患者預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年5月至2020年1月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院首次診治的161 例患者的臨床病理資料，以100 例UC 為試驗組，并以患者的腫瘤最大徑3 cm 再進(jìn)行分組[5-6]，以46 例尿路上皮的良性疾病和15 例健康患者為對照組。試驗組納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡＞18 歲；2）組織病理學(xué)確診為UC 且影像學(xué)檢查除外合并其他腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）受試對象合并血管炎、膿毒性休克和周圍血管疾?。?）不能耐受手術(shù)。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，并得到患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 人外周血CTC 差相富集試劑盒、CD31-iFISH CTC 檢測試劑盒均購自美國Cytelligen 公司，CD45 單克隆抗體購自美國Abbkine公司。G1-8 023 微型臺式真空泵購自中國Kylin-Bell公司，S500-24 熒光原位雜交儀購自德國Leica 公司，DS-Fi1c 顯微鏡相機(jī)購自日本Nikon 公司。

1.2.2 差相富集聯(lián)合免疫染色熒光原位雜交技術(shù) 術(shù)前根據(jù)Lin 等[7]研究采用差相富集聯(lián)合免疫染色熒光原位雜交（subtraction enrichment and immunostainingfluorescenceinsituhybridization，SE-iFISH）技術(shù)富集及識別CTC 和CTEC。血液樣本離心去除血漿，后加入Cytelligen 細(xì)胞分離液去除紅細(xì)胞，再次離心除去白膜層及上清液，加入免疫磁珠（magnetic beads），去除白細(xì)胞，加入清洗液洗滌CTC 和CTEC，可得到富含CTC 和CTEC 的細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液進(jìn)行固定、干燥、封片，最后依次加入CEP-8 探針雜交、CD45 單克隆抗體、CD31 單克隆抗體以及DAPI 細(xì)胞核染色液進(jìn)行細(xì)胞染色，由兩位檢驗科醫(yī)生在熒光顯微鏡下鑒定CTC、CTEC。

1.2.3 CTC 和CTEC 結(jié)果判定 熒光顯微鏡下讀片，在紅色通道下尋找可疑細(xì)胞，無紅色外圈（CD45）的藍(lán)色細(xì)胞核（DAPI）細(xì)胞為可疑目標(biāo)，并觀察CTC 中的紅色亮點是否在細(xì)胞核內(nèi)；再轉(zhuǎn)橙色通道確認(rèn)熒光信號點（CEP8）是否≥3 個；最后轉(zhuǎn)綠色通道，觀察可疑細(xì)胞核周是否有綠色信號（CD31）。CTC 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陰性、CEP8≥3 倍體，CTEC 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陽性、CEP8≥3 倍體。依據(jù)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）確定CTC 和CTEC 的診斷截斷值，并分為陽性組和陰性組。

1.2.4 隨訪 采用電話或定期門診隨訪，UC 患者術(shù)后1年內(nèi)每間隔3 個月隨訪1 次，1～3年內(nèi)每間隔6個月隨訪1 次，內(nèi)容包括影像學(xué)和膀胱鏡檢查。檢查結(jié)果懷疑復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者，診斷以組織病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)。主要終點事件為無進(jìn)展生存（progression-free survival，PFS）期，為采集血液樣本至術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間。隨訪截至2021年1月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2分析，采用Kaplan-Meier 法和Log rank 法進(jìn)行生存分析，采用 Cox 比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC 和CTEC 的形態(tài)特征

在熒光顯微鏡下，CTC 為1 個圓形藍(lán)色熒光核，核內(nèi)有4 個紅色信號點，其中DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陰性、CEP8 為4 倍體（圖1A）。CTEC 表現(xiàn)為1 個圓形藍(lán)色熒光核，核內(nèi)有7 個紅色信號點，可見核周成簇點狀綠色信號，其中DAPI 陽性、CD45 陰性、CD31 陽性、CEP8 為7 倍體（圖1B）。

圖1 熒光顯微鏡下CTC 和CTEC 陽性形態(tài)特征

2.2 CTC 和CTEC 截斷值的判定

試驗組中CTC 和CTEC 陽性率分別為74/100（74.0%）和66/100（66.0%），與對照組中的6/61（9.8%）和3/61（4.9%）進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。CTC 的ROC 曲線AUC 為0.844，當(dāng)切點為0.5 時Youden 指數(shù)最大；CTEC 的AUC 為0.812，當(dāng)切點為0.5 時Youden 指數(shù)最大。因CTC 和CTEC 只能取整數(shù)，故以每7.5 mL 外周靜脈血中CTC 或CTEC 判定≥1 個為陽性指標(biāo)（圖2）。

圖2 試驗組與對照組的CTC 和CTECROC 曲線分析

2.3 術(shù)前UC 患者的CTC 和CTEC 陽性率與臨床特征的關(guān)系

UC 患者的腫瘤最大徑＜3 cm 的CTC 陽性率為64.8%（35/54），最大徑≥3 cm 為84.8%（39/46），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023）；多發(fā)病灶患者的CTEC陽性率為80.5%（33/41），單發(fā)病灶為55.9%（33/59），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011）；患者的CTC 陽性率與病理類型、分化程度、腫瘤T 分期、病灶數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），CTC 和CTEC 陽性率與其他臨床特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 100 例UC 患者的臨床特征與術(shù)前CTC 及CTEC 檢測情況的關(guān)系

表1 100 例UC 患者的臨床特征與術(shù)前CTC 及CTEC 檢測情況的關(guān)系 （續(xù)表1）

2.4 生存分析

100 例UC 患者中位隨訪時間為14（1～24）個月，其中25 例發(fā)生復(fù)發(fā)或死亡。單因素分析顯示腫瘤T分期、病灶數(shù)、CTC 組、CTEC 組與PFS 具有顯著性相關(guān)。將單因素分析中有意義的臨床因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型多因素分析，CTEC 組為患者PFS的獨立預(yù)后因素（P=0.05，表2～3）。

表2 影響UC 患者預(yù)后的Cox 比例風(fēng)險回歸模型單因素分析

CTC 和CTEC 陽性組中位隨訪時間分別為12.0個月和12.5 個月，分別短于陰性組的20.0 個月和16.5 個月。Kaplan-Meier 法分析顯示，腫瘤T3～4期、CTC 和 CTEC 陽性組的術(shù)后PFS 顯著短于腫瘤T1～2期、CTC 和CTEC 陰性組（P＜0.05），采用Log rank 法分析顯示CTEC 組與PFS 相關(guān)性最大（P=0.002）。將CTC 組和CTEC 組中同時陽性的患者視為陽性，其余患者視為陰性，結(jié)果顯示與PFS 具有顯著性相關(guān)（P＜0.001，圖3）。

表3 影響UC 患者預(yù)后的Cox 比例風(fēng)險回歸模型多因素分析

圖3 Kaplan-Meier 法分析術(shù)前各因素對患者術(shù)后PFS 的影響

3 討論

循環(huán)罕見細(xì)胞（CRC）主要由CTC 和CTEC 組成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，從原發(fā)病灶脫落的腫瘤細(xì)胞可發(fā)生局部浸潤、游走進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)、定植靶器官、外滲和遷移，最終形成新的微小轉(zhuǎn)移病灶，而腫瘤的進(jìn)展取決于血管生成，CTEC 是促進(jìn)腫瘤血管生成的重要生物標(biāo)志物[8]。盡管持續(xù)有腫瘤細(xì)胞從病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中，但其中絕大部分會因機(jī)體的免疫力和血流剪切力或氧化應(yīng)力而被清除[9]。因此，腫瘤患者外周血中的CTC 和CTEC 含量極低，CTC 幾乎在每1 億個外周血細(xì)胞中僅有1 個[10]，檢測方法的靈敏性顯得尤為重要。本研究采用SE-iFISH 技術(shù)是一種新型的檢測手段，結(jié)果顯示CTC 靈敏度為74.0%，CTEC 靈敏度為66.0%。Qi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，基于葉酸受體α（FRα）技術(shù)檢測膀胱癌外周血中的CTC 靈敏度為70%。Flaig 等[12]研究顯示，CellSearch 技術(shù)檢測UC患者的CTC 陽性率僅為27.27%。因此，SE-iFISH 技術(shù)對UC 患者的診斷性能更佳，可能因為檢測過程中不受腫瘤細(xì)胞大小、血液滲透壓以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響[7]。本研究進(jìn)一步分析UC 患者臨床特征與CTC 和CTEC 陽性率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，病理類型、腫瘤最大徑、分化程度、病灶數(shù)和腫瘤T 分期與CTC 陽性率進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中腫瘤T分期越高，患者外周血中的CTC 檢出率亦越高，這可能與T3～4期患者更易發(fā)生進(jìn)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別、浸潤程度、是否血尿進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究對CTEC 陽性率分析發(fā)現(xiàn)，僅病灶數(shù)與CTEC 陽性率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011），可能與CTEC 促進(jìn)腫瘤血管生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Lin 等[4]研究顯示，CTEC 與CTC 的相互作用可能在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和形成過程中有重要的作用。Strijbos 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用多種技術(shù)檢測162 例去勢抵抗性前列腺癌患者的CTC 和CTEC 水平，CTEC數(shù)目增加組與總生存期（overall survival，OS）下降有關(guān)，CTEC 數(shù)目≥5 個的患者同樣為預(yù)測OS 降低的重要因素，Cox 比例風(fēng)險回歸模型多因素分析顯示CTC和CTEC 均為患者OS 獨立因素。Rink 等[14]采用CellSearch 系統(tǒng)檢測術(shù)前100 例膀胱癌患者，23 例CTC 陽性患者中14 例復(fù)發(fā)，而77 例CTC 陰性患者中僅10 例復(fù)發(fā)，Kaplan-Meier 法分析顯示CTC 陽性與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)，并且是腫瘤復(fù)發(fā)和總死亡率的獨立預(yù)測因素。本研究的中位隨訪時間為14（1～24）個月，CTC 和CTEC 陽性組UC 患者的中位隨訪時間明顯短于陰性組，生存分析結(jié)果顯示與PFS 具有顯著性相關(guān)，提示CTC 和CTEC 在疾病的進(jìn)展方面具有預(yù)測價值，CTC 或CTEC 陰性患者與陽性患者相比，發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險顯著升高，對患者預(yù)后風(fēng)險分層具有重要的臨床意義。Cox 比例風(fēng)險回歸模型多因素分析表明，CTEC 是UC 患者唯一的獨立預(yù)后因子，CTEC 陽性患者的腫瘤復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險比是CTEC陰性患者的4.471 倍。未來CTEC 可能成為UC 患者預(yù)后的有力監(jiān)測指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過對CTC 和CTEC 檢測，不僅論證其在預(yù)測UC 患者預(yù)后的作用，也為將來從分子和細(xì)胞層面揭示腫瘤血管生成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，完善患者的臨床診療策略起著重要作用。因受限于試驗樣本量和隨訪時間的影響，仍需進(jìn)行前瞻性、多中心、長時間隨訪進(jìn)一步完善。