腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在甲狀腺乳頭狀癌中的分布及臨床意義的初探*

侯飛 呂娟 楊志賢 李浩宇 鄧智勇

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占全部甲狀腺癌的85%[1]，并有多灶性發(fā)生和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特征。近30年來，甲狀腺癌發(fā)病率持續(xù)增長，目前其發(fā)病率的增速已躍居惡性腫瘤第1 位[2]，致使甲狀腺癌防治工作的形勢十分嚴(yán)峻。因此，探尋影響甲狀腺乳頭狀癌生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物具有重要的意義。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAMs）在腫瘤微環(huán)境中扮演重要的角色，TAMs 可促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管新生，在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展等方面發(fā)揮著重要作用。在不同的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分化為M1 和M2 兩個亞型，存在于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，被稱為TAMs，大部分表現(xiàn)為M2 型。有研究指出[3-4]，CD68 表達(dá)于M1 及M2 型TAMs，是泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，但不能區(qū)分M1 及M2型TAMs，而M2 型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物是CD206。有研究檢測活檢后口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的TAMs，發(fā)現(xiàn)TAMs 在Ⅱ級鱗癌的浸潤明顯多于Ⅰ級鱗癌[5]，顯然TAMs 在分化程度更低的口腔鱗癌浸潤更多，提示TAMs 可能促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。一項研究發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細(xì)胞分泌Wnt 配體激活Wnt/βcatenin 信號通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分化，促進(jìn)結(jié)腸癌的生長。但TAMs 與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理相關(guān)性尚缺乏充分的研究。因此本研究初步探索TAMs 是否與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，選用CD68 與CD206 標(biāo)記巨噬細(xì)胞，了解M2 型TAMs 在甲狀腺癌中的浸潤情況，并分析其與甲狀腺癌碘難治等臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2010年1月至2017年12月云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院就診的甲狀腺癌51 例、甲狀腺良性病變17 例患者的臨床資料，均行手術(shù)切除、病理確診并有完整的組織標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn)：1）本院手術(shù)切除，組織標(biāo)本保存完整；2）術(shù)前未接受化療、放療和靶向治療等；3）病理學(xué)證實，臨床資料完整；4）術(shù)后行規(guī)范131I 治療及TSH 抑制治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）有其他惡性腫瘤或既往腫瘤病史；2）合并其他可能引起體內(nèi)激素變化的疾病及因素；3）患者本身存在可能導(dǎo)致CD68 與CD206 表達(dá)異常的因素。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑、抗體及免疫組織化學(xué)法檢測 試驗抗體CD206（91 992）購自美國CST 公司；CD6（76 437）購自美國CST 公司，Elivision Super HRP（mouse/rabbit）IHCKit 試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購自福州邁新試劑公司。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用已知的陽性組織切片作為陽性對照，用PBS 代表一抗作為陰性對照。根據(jù)入組患者病理號，于本院病理科選取對應(yīng)的標(biāo)本，所有標(biāo)本先用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，以4 μm 厚度進(jìn)行切片，置入60℃烘箱內(nèi)烤片。在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)之前，梯度酒精中水化。切片與抗CD68、CD206（1∶150 稀釋度）一抗在4℃下孵育過夜。PBS 洗滌3 次后，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗在37℃孵育1 h。采用免疫組織化學(xué)法染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法結(jié)果判定 被染色的組織5個高倍視野（×200）下進(jìn)行統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù),得到陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞率0～25%為0 分，26%～50%為1 分，51%～75%為2 分，75%為3 分。按照多數(shù)陽性細(xì)胞表現(xiàn)出的染色強(qiáng)度進(jìn)行記分：無顯色時為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。將上述兩項得分相加：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為中等強(qiáng)度陽性（++），5～6 分為強(qiáng)陽性（+++）。以CD68 陽性判定為通用型TAMs，記為CD68+TAMs；CD206 陽性判定為M2型TAMs,記為CD206+TAMs；CD68 與CD206 均表達(dá)陽性，記為CD68+/CD206+TAMs。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。樣本率的比較使用χ2檢驗，有序定性資料使用秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

所有病例中，男性26 例，女性42 例，年齡15～71 歲，平均年齡45（45±16）歲。甲狀腺癌51 例，其中PTC 42 例、鱗狀細(xì)胞癌9 例。甲狀腺良性病變17 例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫9 例、濾泡性腺瘤8 例。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在甲狀腺良性病變及甲狀腺癌組織中，CD68 與CD206 均定位于巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜和（或）胞質(zhì)中，表現(xiàn)為黃褐色或者是棕褐色顆粒狀（圖1）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，42 例PTC 組織中主要有CD68+/CD206+細(xì)胞和CD68-/CD206+兩種陽性細(xì)胞，在甲狀腺癌組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)CD68+/CD206-細(xì)胞存在。本研究42 例PTC 組織中，存在CD68+TAMs 分布的患者為14 例，存在CD206+TAMs 分布為37 例；存在CD68+/CD206+TAMs 分布為14 例，存在CD68-/CD206-TAMs 分布為5 例，存在CD68-/CD206+TAMs 分布為23 例。

圖 1 采用免疫組織化學(xué)法檢測甲狀腺癌和甲狀腺良性病變組織中CD68+TAMs 與CD206+TAMs 的表達(dá)

2.3 CD68+、CD206+和CD68+/CD206+TAMs 在甲狀腺癌與甲狀腺良性病變組織中的比較

CD68+TAMs、 CD206+TAMs 和 CD68+/CD206+TAMs 在甲狀腺癌組織中的分布強(qiáng)度均高于甲狀腺良性病變，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.121，P=0.034；Z=-2.026，P=0.043；χ2=-2.080，P=0.038），見表1。

表1 CD68+TAMs、CD206+TAMs 在甲狀腺良惡性病變中分布的比較

2.4 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 在PTC組織中的分布與臨床病理特征之間的關(guān)系

CD68+TAMs 的分布強(qiáng)度在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及腫瘤大小≥2 cm 組中，分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和腫瘤大小＜2 cm 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.462，P=0.014；Z=-2.19，P=0.029），見圖2。同樣，CD68+/CD206+TAMs 在上述兩組中的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.979，P=0.014；χ2=4.725，P=0.030），見圖3。CD68+TAMs 和CD68+/CD206+TAMs 的分布在PTC患者性別、年齡、甲狀腺外是否受侵、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、單灶或多灶、是否碘難治及AJCC Ⅰ+Ⅱ期/Ⅲ+Ⅳ期中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。CD206+TAMs的分布在所有臨床病理特征中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖2 PTC 中CD68+TAMs 分布與腫瘤大小及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

圖3 PTC 中CD68+/CD206+TAMs 的分布與腫瘤大小及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.5 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 的分布與PTC 腫瘤大小及分期的關(guān)系

在42 例PTC 組織中，腫瘤大小＜2 cm 組和Ⅰ+Ⅱ期組，CD206+TAMs 陽性例數(shù)多于CD68+TAMs，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-4.275，P＜0.001；Z=-4.421，P＜0.001）；而在腫瘤大小≥2 cm 組和Ⅲ+Ⅳ期 組，CD68+TAMs 與CD206+TAMs 分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.465，P=0.178；Z=-1.053，P=0.353），見表2，3。

表2 PTC 中CD68+TAMs、CD206+TAMs 的分布與腫瘤大小的關(guān)系

2.6 CD68+TAMs 與CD206+TAMs 相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析表明，PTC 患者組織中CD68+TAMs 與CD206+TAMs 分布水平呈正相關(guān)（r=0.322，P=0.038）。

2.7 CD68+、CD206+及CD68+/CD206+TAMs 的分布與PTC 患者甲狀腺相關(guān)激素水平之間的關(guān)系

CD68+TAMs 的分布強(qiáng)度分別在42 例PTC 患者術(shù)前的T3、TgAb、FT3 及FT4 正常組與異常組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.242，P＜0.001；Z=-1.986，P=0.047；Z=-3.080，P=0.002；Z=-2.682，P=0.007）。

CD68+/CD206+TAMs 的分布強(qiáng)度分別在患者術(shù)前的T3、FT3 及FT4 正常組與異常組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.842，P=0.009；χ2=10.371，P=0.005；χ2=11.351，P=0.002）。CD206+TAMs 分布情況在患者術(shù)前血清甲狀腺激素：T3、T4、TSH、TG、TgAb、TMAB、FT3、FT4、rT3 正常組與異常組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 PTC 中CD68+TAMs、CD206+TAMs 的分布與腫瘤分期的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤本身的生物學(xué)特性有關(guān)，且與腫瘤所在的微環(huán)境緊密相連。在不同的微環(huán)境里，巨噬細(xì)胞可以分化為M1、M2 兩個亞型，即通過經(jīng)典激活途徑來源的M1 表型和替代激活途徑來源的M2 表型。M1 型TAMs 顯示腫瘤抑制功能，能夠殺死微生物或腫瘤細(xì)胞，M2 型TAMs 有促進(jìn)腫瘤血管生成、淋巴管生成、基質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)移的作用[6]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞大部分表現(xiàn)為M2 型，表達(dá)與M2 型相似的分子標(biāo)記和細(xì)胞因子，如CD163、CD206 等[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，TAM 與多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，如乳腺癌、膀胱癌和食管癌等[9-11]。然而國內(nèi)外關(guān)于TAMs在甲狀腺癌中的研究較少。

實際上，CD68 被認(rèn)為經(jīng)典的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，代表兩種具有相反生物學(xué)特性的巨噬細(xì)胞，即M1 和M2 型TAMs[12]，僅以CD68+TAMs 來研究其與甲狀腺的相關(guān)性并不可靠。因此，本研究以CD68 標(biāo)記M1型TAMs 與M2 型TAMs，以CD206+TAMs 指標(biāo)來表示M2 型TAMs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PTC 患者中，CD206+TAMs患者比CD68+TAMs 患者多，此與國內(nèi)外文獻(xiàn)所報道的TAMs 和M2 型TAMs 的從屬關(guān)系不一致[12-13]。有報道，樹突狀細(xì)胞同樣表達(dá)CD206[14]，可以猜測PTC微環(huán)境中可能有其他細(xì)胞表達(dá)CD206。本研究發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs、CD206+TAMs 和CD68+/CD206+TAMs 在甲狀腺癌中的分布強(qiáng)度均高于甲狀腺良性病變組織，提示甲狀腺腫瘤微環(huán)境里存在腫瘤有關(guān)的炎癥，TAMs 可能促進(jìn)了甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展。上述情況發(fā)生可能是由于腫瘤細(xì)胞或者間質(zhì)分泌了趨化因子，如CCL2、CCL5 和CCL7 等吸引外周循環(huán)中存在的巨噬細(xì)胞，或腫瘤微環(huán)境里的單核細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[15]。本研究采用Spearman 等級相關(guān)性分析表明，PTC 患者中CD68+TAMs 與CD206+TAMs 分布水平呈正相關(guān)，說明PTC 微環(huán)境中TAMs 在偏向M2 型TAMs 極化的趨勢可能。

本研究得出在42 例PTC 組織中，CD68+TAMs的分布強(qiáng)度在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及腫瘤大小≥2 cm 組中均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和腫瘤大?。? cm 組，同樣，CD68+/CD206+TAMs 在上述兩組中的分布強(qiáng)度也具有明顯不同，證明了TAMs 可能與PTC 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小有關(guān)。另外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD206+TAMs 在腫瘤大小＜2 cm 和腫瘤分期Ⅰ期或Ⅱ期的情況下分布強(qiáng)度高于CD68+TAMs，然而在腫瘤大小≥2 cm 組中兩者的分布強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有報道提示[16]，在腫瘤生長早期階段，TAMs 極化主要是以M1 型TAMs 占主導(dǎo)，M2 型TAMs 數(shù)量較少，此時的TAMs 主要是抗腫瘤，當(dāng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展至一定階段，腫瘤微環(huán)境里各種細(xì)胞因子影響下，TAMs 主要是以M2 型為主導(dǎo)，轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌[瘤作用。這與上述研究結(jié)果相矛盾，本研究推測在PTC 生長早期，其微環(huán)境中M1 型TAMs 可能主導(dǎo)極化的時間不長，主要以M2 型TAMs 極化為主。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs 的分布與患者術(shù)前甲狀腺相關(guān)激素T3、TgAb、FT3 及FT4 水平相關(guān)；CD206+/CD206+TAMs的分布與患者的T3、FT3 及FT4 水平相關(guān)。本研究推測，TAMs 還可能參與甲狀腺激素的調(diào)節(jié)，或體內(nèi)甲狀腺激素變化水平對M2 型TAMs 分布有影響，其兩者之間是如何相互作用的需要進(jìn)一步探索。

本研究的局限性為回顧性研究，需要更大的樣本量，多中心的研究來得出更具有代表性的結(jié)果。本研究僅納入甲狀腺乳頭狀癌及鱗狀細(xì)胞癌，未納入濾泡狀癌、髓樣癌及未分化癌，良性病變的病例也較少，后續(xù)需要繼續(xù)補(bǔ)充病例，完善研究。粗略的探索TAMs在甲狀腺癌組織中的分布情況，后續(xù)需要進(jìn)一步研究其對甲狀腺癌的作用的分子機(jī)制。

綜上所述，M2 型TAMs 在腫瘤微環(huán)境中可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展；暫未發(fā)現(xiàn)TAMs 在甲狀腺癌碘難治組與碘易治組之間確切的差異性分布。TAMs 與PTC 的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及血清甲狀腺相關(guān)激素水平可能有關(guān)，其之間是如何相互作用的需要更為深入的研究。另外，本研究給臨床診治帶來一種思路，可以通過研究一種靶向M2 型TAMs向M1 型TAMs 轉(zhuǎn)變，或直接消滅M2 型TAMs 的藥物，為甲狀腺癌的治療提供一種新的策略。