基于PI3K/Akt通路研究利拉魯肽對(duì)2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的作用

張瑩 周艷紅 李江雁 趙建林 吳蘇豫 熊承云 孫超

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

2型糖尿病性骨質(zhì)疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)屬全身性代謝疾病，主要影響骨量丟失和骨組織改變，誘發(fā)病理性骨折，導(dǎo)致致殘率、死亡率增加[1]。尋找安全有效的治療方法是目前治療T2DOP的重點(diǎn)。利拉魯肽作為一種人胰高血糖素樣肽-1類似物，可直接或間接影響胰高血糖素分泌，從而改變胰島功能[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphateidylinositol-3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)通路是重要的胰島素信號(hào)通路，是胰島素發(fā)揮作用的重要傳導(dǎo)通路[3]；同時(shí)亦是骨代謝的主要調(diào)節(jié)因子，可以定向誘導(dǎo)骨分化，促進(jìn)骨形成[4]。但利拉魯肽是否通過PI3K/Akt通路在T2DOP中發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本研究通過高脂高糖飼料、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)并摘除卵巢誘導(dǎo)建立T2DOP大鼠模型，探究利拉魯肽對(duì)T2DOP大鼠的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD大鼠，SPF級(jí)，購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(200±10)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0007，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2019-0021，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：JS19034721。在溫度(24±0.5)℃、光照/黑暗(12/12) h、正常飲水?dāng)z食條件下飼養(yǎng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)行人道主義關(guān)懷，符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

PI3K抑制劑LY294002(成都易萊生物科技有限公司，批號(hào)：T2008)；利拉魯肽注射液(諾和諾德中國制藥有限公司，規(guī)格3 mL∶18 mg，批號(hào)：20190317)；STZ(美國Sigma公司，批號(hào)：S0131)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色試劑盒(上海生工生物技術(shù)公司，批號(hào)：E607318)；聚偏氟乙烯膜(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：FFP28)；大鼠骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、細(xì)胞核因子KB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、羊抗鼠磷酸化-PI3K(p-PI3K)、PI3K、磷酸化-Akt(p-Akt)、Akt、GAPDH一抗、羊抗鼠IgG二抗(英國abcam公司，批號(hào)分別為：ab255723、ab269553、ab109006、ab139307、ab00133、ab8805、ab151279、ab6721)。血糖儀(上海羅氏制藥有限公司，型號(hào)：BG-102)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號(hào)：CKX53)；雙能X射線密度儀(上海碩舟電子科技有限公司，型號(hào)：CB3351MD)；凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司，型號(hào)：Gel Doc XR+)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥處理

高脂高糖飼料提前混勻，各組分比例：正常飼料66.5%、豬油30%、膽固醇2.5%、脫氧膽酸1%。大鼠參考文獻(xiàn)[5]建立T2DOP模型，高脂高糖飼料飼養(yǎng)大鼠8周，8周末禁食12 h后腹腔注射30 mg/kg STZ建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)模型，T2DM模型以尾靜脈采血空腹血糖水平高于16.7 mmol/L為造模成功，42只大鼠模型成功30只，成功率71.43%；T2DM模型建立成功后采用摘除卵巢方法制備骨質(zhì)疏松(osteporsis，OP)模型，30只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、利拉魯肽組、利拉魯肽+LY294002組，每組10只；另設(shè)正常飼養(yǎng)大鼠10只作為正常組。利拉魯肽組皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽[6]，利拉魯肽+LY294002組皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽和1 mg/kg LY294002的混合物[7]，正常組和模型組皮下注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)8周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1體重檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量大鼠體重。

1.4.2血糖儀檢測(cè)血糖水平：尾靜脈抽血，血糖儀檢測(cè)尾靜脈血中空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平。

1.4.3HE染色觀察大鼠股骨組織形態(tài)：立即處死大鼠，股骨組織置于4%多聚甲醛中固定，EDTA脫鈣液脫鈣處理。HE染色試劑盒檢測(cè)大鼠股骨組織情況，顯微鏡下拍照觀察。

1.4.4ELISA檢測(cè)血清中OPG、RANKL水平：尾靜脈血室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清，大鼠OPG、RANKL ELISA試劑盒檢測(cè)血清中OPG、RANKL水平。

1.4.5雙能X射線吸收法測(cè)定股骨組織骨密度：雙能X射線密度儀檢測(cè)各組股骨組織骨密度。

1.4.6蛋白免疫印跡檢測(cè)股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平：股骨組織立即浸入液氮中，研磨至細(xì)粉，加入RIPA強(qiáng)效裂解液，冰上勻漿30 min，4 ℃離心機(jī)3 500 r/min離心20 min，吸取上清即為股骨組織總蛋白。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉；分別加入一抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH(均為1∶2000稀釋)，4 ℃孵育過夜；加入羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀釋)，室溫孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對(duì)大鼠體重及FBG的影響

與正常組相比，模型組大鼠體重、FBG水平升高(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠體重、FBG水平降低(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠體重、FBG水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠體重、FBG水平比較Table 1 Comparison of body weight and FBG level among rats in 4 groups (n=10,

2.2 利拉魯肽對(duì)大鼠股骨組織形態(tài)的影響

正常組骨小梁形態(tài)正常；模型組骨小梁破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯斷裂現(xiàn)象，變薄和分離明顯；利拉魯肽組骨小梁空隙間隔有所緩解，數(shù)量有所增加，厚度有所增厚；利拉魯肽+LY294002組相較于利拉魯肽組骨小梁斷裂明顯，厚度降低。見圖1。

圖1 4 組大鼠股骨組織形態(tài)情況(HE染色，400×)A：正常組，B：模型組，C：利拉魯肽組，D：利拉魯肽+LY294002組Fig.1 The morphology of the femur in rats of the 4 groups (HE staining, 400×)A: Normal group; B: Model group; C: Liraglutide group; D: Liraglutide + LY294002 group

2.3 利拉魯肽對(duì)大鼠血清中OPG、RANKL水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中OPG水平降低、RANKL水平升高(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠血清中OPG水平升高、RANKL水平降低(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠血清中OPG水平降低、RANKL水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清中OPG、RANKL水平比較Table 2 Comparison of serum OPG and RANKL levels in rats of the 4 groups

2.4 利拉魯肽對(duì)大鼠股骨組織骨密度的影響

與正常組相比，模型組大鼠股骨組織骨密度降低(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠股骨組織骨密度升高(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠股骨組織骨密度降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠股骨組織骨密度比較Table 3 Comparison of bone mineral density of the femur in rats of the 4 groups (n=10,

2.5 利拉魯肽對(duì)大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平升高(P<0.05)；與利拉魯肽組相比，利拉魯肽+LY294002組大鼠股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白情況A：正常組；B：模型組；C：利拉魯肽組；D：利拉魯肽+LY294002組Fig.2 p-PI3K, PI3K, p-Akt, and Akt proteins in the femoral tissues of rats in the 4 groupsA: Normal group; B: Model group; C: Liraglutide group; D: Liraglutide + LY294002 group

表4 4組大鼠股骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較Table 4 Comparison of protein levels of p-PI3K, PI3K, p-Akt, and Akt in the femur in rats of the 4 groups (n=10,

3 討論

糖尿病可誘發(fā)多個(gè)系統(tǒng)和器官損害，在骨骼系統(tǒng)中導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨折愈合延遲或不愈合現(xiàn)象，造成骨形成和骨吸收打破，使骨代謝紊亂，影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后[8]。在發(fā)病機(jī)制中，胰島素分泌不足、胰島素抵抗，胰高血糖素分泌增加是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制[9]。而抑制胰高血糖素高分泌研究相對(duì)較少。胰高血糖素樣肽-1不僅可改善胰島β細(xì)胞功能、增加胰島β細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)可抑制胰島α細(xì)胞上N型鈣離子通道等，共同作用抑制胰高血糖素的分泌，從而改善胰島α細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性，從而達(dá)到降血糖的目的[10]，而利拉魯肽作為胰高血糖素樣肽-1類似物，可能具有類似效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組體重、FBG水平升高，骨小梁破壞嚴(yán)重、骨密度降低，提示T2DOP大鼠模型制備成功。而利拉魯肽作用后發(fā)現(xiàn)大鼠體重下降、血糖水平有所降低，骨小梁結(jié)構(gòu)有所緩和，骨組織功能得以緩解，骨密度升高，證明利拉魯肽可以緩解T2DOP癥狀，但其作用機(jī)制尚需研究。

OPG作為可溶性糖蛋白，對(duì)骨組織有特異性作用，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、成熟等，可增加骨密度、抑制破骨細(xì)胞生成，是骨細(xì)胞分化的決定性分子[11]。RANKL是破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨吸收，是調(diào)節(jié)骨質(zhì)重建的關(guān)鍵因子[12]。OPG與RANKL相互調(diào)節(jié)，可評(píng)估骨損傷情況，升高OPG、降低RANKL可阻斷鈣質(zhì)流失和骨質(zhì)流失[13]。PI3K/Akt通路存在于所有哺乳動(dòng)物中，且受細(xì)胞外一系列信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]，其中PI3K作為一種信號(hào)分子，參與胰島素信號(hào)通路過程，導(dǎo)致T2DOP的產(chǎn)生[15]；LY294002作為PI3K抑制劑，可特異性抑制PI3K上p110亞單位，阻止下游3,4,5-三磷酸肌醇底物的產(chǎn)生[16]。Akt作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，PH結(jié)構(gòu)域可與3,4,5-三磷酸肌醇底物結(jié)合，使得Akt激酶聚集于質(zhì)膜上，使得相關(guān)基因磷酸化，進(jìn)而影響下游的相關(guān)靶基因[17]。而Akt是由RANKL在破骨細(xì)胞生成過程中激活的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，RANKL可進(jìn)入細(xì)胞，介導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞分泌的相關(guān)因子與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的受體結(jié)合，同時(shí)再介導(dǎo)Akt通路等參與破骨細(xì)胞成熟[18]。且PI3K/Akt通路在糖尿病[19]和骨質(zhì)疏松[20]中均研究廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠血清中OPG水平、股骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低，血清中RANKL水平升高，提示在T2DOP大鼠中PI3K/Akt通路受到抑制，從而降低骨密度、增加破骨細(xì)胞生成、分化，影響骨質(zhì)重建。添加利拉魯肽后PI3K/Akt通路被激活從而升高OPG水平、降低RANKL水平，導(dǎo)致骨密度增加且同時(shí)抑制破骨細(xì)胞分化，鈣質(zhì)流失和骨質(zhì)流失，從而緩解高脂肪導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。在利拉魯肽基礎(chǔ)上添加LY294002可逆轉(zhuǎn)PI3K/Akt通路，且與單純的添加利拉魯肽相比，大鼠骨質(zhì)疏松癥狀嚴(yán)重，說明利拉魯肽在T2DOP中通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。

綜上所述，利拉魯肽在T2DOP大鼠中通過激活PI3K/Akt通路增加骨密度、抑制破骨細(xì)胞生成從而緩解疾病。但PI3K/Akt通路對(duì)骨密度、破骨細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不清楚，是下一步研究重點(diǎn)。