支氣管肺泡灌洗液二代測序在指導(dǎo)血液腫瘤患者伴發(fā)難治性肺部感染診治中的應(yīng)用

陸雯萍，費小明，丁明，余先球，王麗霞，雷芳，湯郁，歐陽健

血液腫瘤患者化療后骨髓抑制常常導(dǎo)致中性粒細胞缺乏(粒缺)。此外，其它因素如化療藥的免疫抑制、糖皮質(zhì)激素、長期廣譜抗生素、中心靜脈導(dǎo)管等，也是引起感染的重要危險因素[1-3]。臨床上經(jīng)常出現(xiàn)感染性發(fā)熱，這類患者在一開始出現(xiàn)發(fā)熱時，臨床上可參照國內(nèi)外相關(guān)應(yīng)用指南[4-6]進行經(jīng)驗性抗感染治療。但是有一部分患者初始治療有效后，再次出現(xiàn)發(fā)熱或者經(jīng)驗性抗感染治療無效，對于這一部分患者如何處理是一個臨床上的難題，抗感染治療的核心之一是感染病原體的確定。目前血液和痰液培養(yǎng)[7-10]，血清1,3-β-D葡聚糖(G)試驗和血清半乳甘露聚糖(GM)試驗檢查[11-13]，均存在檢出率低、干擾因素多等缺點。這不可避免地導(dǎo)致了臨床上盲目和無效地使用抗菌藥物，增加了患者的致殘和致死率。針對血液病腫瘤患者抗感染治療的迫切需要，我們嘗試對于這部分再次發(fā)熱或初始治療無效的患者，在發(fā)現(xiàn)新的肺部影像學(xué)變化纖支鏡下行BAL后，取BALF用NGS方法查找病原體，并根據(jù)相應(yīng)的病原體來調(diào)整抗菌藥物的策略。本文對江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院血液科近期收治的伴發(fā)感染的4例血液腫瘤患者進行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年7月—2021年2月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院血液科住院收治的4例血液腫瘤患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18周歲；(2)血液惡性腫瘤患者化療后發(fā)熱，參照國內(nèi)外針對粒缺伴發(fā)熱患者的抗菌藥物應(yīng)用指南[4-9]給予經(jīng)驗性抗感染治療，且經(jīng)過至少二線的抗感染藥物調(diào)整，患者的感染癥狀經(jīng)先前治療后，沒有緩解或一度緩解后再度出現(xiàn)，同時在CT上有新的影像學(xué)改變；(3)患者簽署纖支鏡下肺泡灌洗術(shù)知情同意書及NGS檢測知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重度通氣和(或)換氣功能障礙；(2)新發(fā)的急性冠狀動脈綜合征、嚴(yán)重高血壓及惡性心律失常；(3)主動脈瘤和食管靜脈曲張有破裂風(fēng)險；(4)嚴(yán)重的凝血功能障礙、大咯血等；(5)多發(fā)性肺大皰有破裂風(fēng)險；(6)嚴(yán)重消耗性疾??；(7)患者不能良好配合。

1.2 檢測方法 纖支鏡肺泡灌洗術(shù)具體操作步驟參照《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識(2017年版)》[14]。操作結(jié)束后使用無菌管回收BALF，使用40 mL無菌管分裝約5 mL BALF，立即4 ℃保存24 h內(nèi)冷藏運輸送檢。NGS檢測由杰毅生物技術(shù)有限公司采用Q-mNGSTM定量方法進行宏基因組檢測。具體步驟如下：取BALF樣本加入到NGSmasterTM自動化工作站中進行自動化的核酸提取、核酸片段化、末端補平、末端腺苷化(3’端加單堿基A)、測序接頭連接、純化后形成測序文庫。將文庫通過熒光定量PCR儀進行文庫定量后，使用Illumina NextseqTM高通量測序平臺對文庫進行鳥槍法測序。每個文庫預(yù)期讀取產(chǎn)生2 000萬條單端75 bp的序列數(shù)據(jù)。對讀取的文庫序列數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，過濾其中的人類基因組序列數(shù)據(jù)(GRCh38.p13)，將其余序列數(shù)據(jù)與微生物參考數(shù)據(jù)庫(NCBIGenBank和內(nèi)部策劃的微生物基因組數(shù)據(jù))進行比對，以確定微生物物種和相對豐度。

2 病例診治經(jīng)過及結(jié)果

病例1，女，45歲，診斷為復(fù)發(fā)費城染色體(Ph)(+)急性淋巴細胞白血病(ALL)。于2020年7月9日起予R-HyperCVAD方案的A方案挽救化療。7月27日起患者出現(xiàn)粒細胞減少伴發(fā)熱，體溫最高達38.7 ℃，期間多次血培養(yǎng)、血清G試驗和血清GM試驗均陰性，胸部CT平掃示兩肺多發(fā)斑點斑片影，境界模糊，以兩肺上葉為著，給予亞胺培南西司他丁鈉、萬古霉素、伏立康唑抗感染治療后，仍反復(fù)發(fā)熱。8月3日患者體溫較前升高，最高達40.0 ℃，復(fù)查胸部CT平掃示兩肺多發(fā)斑片影較前片明顯進展。8月5日進行BAL檢查：NGS提示為耶氏肺孢子菌，當(dāng)日患者停用亞胺培南西司他丁鈉、萬古霉素、伏立康唑，予復(fù)方磺胺甲噁唑片單藥治療后，8月9日患者體溫正常，復(fù)查胸部CT示兩肺多發(fā)斑片影較前明顯吸收。見圖1。

1A 第1次發(fā)熱時(X線) 1B 行BAL檢查前(CT) 1C 治療后(CT)圖1 病例1患者2次發(fā)熱時及根據(jù)NGS結(jié)果調(diào)整治療后的影像學(xué)改變

病例2，女，45歲，診斷為復(fù)發(fā)Ph(+)ALL。于2020年12月22日起予TKI抑制劑Ponatinib+hyper-CVAD方案的A方案挽救化療，12月25日起患者出現(xiàn)粒細胞減少伴發(fā)熱，體溫最高達39.1 ℃，伴咳嗽、咳痰，期間多次血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)、血清G試驗和血清GM試驗均陰性，胸部X線未見明顯異常，給予亞胺培南西司他丁鈉、復(fù)方磺胺甲噁唑片抗感染治療。2021年1月1日患者體溫正常，1月4日停用亞胺培南西司他丁鈉。1月5日患者再次發(fā)熱，體溫最高達39.2 ℃，伴粒缺，期間多次痰培養(yǎng)、血清G試驗和血清GM試驗均陰性，復(fù)查胸部CT平掃示右肺上葉斑片狀高密度影，境界欠清。1月5日開始加用哌拉西林他唑巴坦鈉、伏立康唑抗感染治療，患者仍反復(fù)發(fā)熱。1月11日進行BAL檢查：NGS提示為奇異勞特普羅氏菌。1月12日停用哌拉西林他唑巴坦鈉、伏立康唑，予亞胺培南西司他丁鈉單藥治療后，1月18日患者體溫正常，復(fù)查胸部CT平掃示右肺上葉高密度影較前明顯減小。

病例3，男，59歲，診斷多發(fā)性骨髓瘤(MM)。于2020年11月6日起予VTD方案化療，11月7日起患者出現(xiàn)發(fā)熱，體溫達40.0 ℃，期間多次血培養(yǎng)、血清G試驗和血清GM試驗均陰性，胸部X線示右下肺少許滲出性病灶，給予哌拉西林他唑巴坦鈉抗感染治療，11月14日患者體溫正常，11月15日停用哌拉西林他唑巴坦鈉。11月24日患者再次發(fā)熱，體溫高達39.4 ℃。期間多次血培養(yǎng)、血清G試驗和血清GM試驗均陰性，復(fù)查胸部CT平掃示左肺上葉見大片狀密度增高影，境界欠清。11月24日予亞胺培南西司他丁鈉、伏立康唑聯(lián)合抗感染治療，患者仍反復(fù)發(fā)熱。11月25日進行BAL檢查：NGS提示為煙曲霉，11月26日停用亞胺培南西司他丁鈉，繼續(xù)予伏立康唑單藥抗真菌治療后，12月4日患者體溫正常，復(fù)查胸部CT平掃示兩肺斑片斑點條索影較前明顯吸收。

病例4，女，47歲，診斷MM。2020年12月12日患者在家予IRD方案口服藥物化療，12月16日起患者出現(xiàn)粒細胞減少伴發(fā)熱，期間查血培養(yǎng)陰性，胸部X線未見明顯異常，給予哌拉西林他唑巴坦鈉抗感染治療，2021年1月1日體溫正常。1月17日患者再次發(fā)熱，體溫38.4 ℃，伴粒缺，復(fù)查胸部CT平掃提示兩肺多發(fā)結(jié)節(jié)影和斑片影，1月17日先后予頭孢他啶、亞胺培南西司他丁鈉抗感染治療，患者仍反復(fù)發(fā)熱。1月26日進行BAL檢查：NGS提示為煙曲霉，血清GM試驗陽性、痰培養(yǎng)示煙曲霉(結(jié)果均在BAL檢查NGS之后)。1月27日停用亞胺培南西司他丁鈉，加用伏立康唑、卡泊芬凈抗真菌治療后體溫較前降低，但未降至正常體溫，2月11日加用兩性霉素B聯(lián)合抗真菌治療后，2月19日患者體溫正常，復(fù)查胸部CT平掃示兩肺多發(fā)斑片、結(jié)節(jié)影較前明顯吸收。4例患者基本信息見表1。

表1 4例患者出現(xiàn)新的肺部影像學(xué)改變前后的診治過程及結(jié)果

3 討論

感染是血液腫瘤患者治療過程中常見的并發(fā)癥，不但可以導(dǎo)致多種臨床癥狀，而且還會增加治療費用和影響后續(xù)抗腫瘤治療，嚴(yán)重時可以直接導(dǎo)致患者死亡。而肺部感染是血液腫瘤患者感染的常見類型[1]。由于血液腫瘤患者在感染時常常合并有白細胞減少和(或)功能異常，并可能同時存在免疫抑制、糖皮質(zhì)激素和長期廣譜抗生素等使用，以及免疫球蛋白減少、粘膜潰瘍等情況，其病原菌復(fù)雜多變，并且重癥患者比例較高[1]。對于經(jīng)過多線抗感染治療的患者，病程中又出現(xiàn)新的肺部影像學(xué)改變，這時抗感染治療尤其困難。傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)、G試驗和GM試驗，不但陽性率不高，還存在假陽性和假陰性，并且無法及時得到結(jié)果[13,15]。痰液培養(yǎng)和涂片檢查是尋找肺部感染病原的重要方法，而臨床上常規(guī)血、痰、分泌物鏡檢和培養(yǎng)存在檢出率低、雜菌污染、難以發(fā)現(xiàn)少見致病菌等不足[7-10]。纖支鏡下取BALF進行病原體檢查是目前推薦的方法，不但可以減少定植菌的污染，而且可以到達病灶部位，增加致病菌檢出的機會[7,11-12]。二代測序作為一種高通量的基因測序技術(shù)，可以同時檢測成千上萬種細菌、真菌和病毒等不同病原體，近年來被嘗試用于病原學(xué)的檢查，其與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法相結(jié)合，有助于提高病原體的檢出率，使臨床抗感染治療更有針對性[16-18]。

本文中報道的4例患者，均為反復(fù)和(或)難治的感染患者，并且在行纖支鏡取BALF前有新出現(xiàn)的肺部影像學(xué)改變；另外，在BALF的NGS檢測前，所有患者經(jīng)血、痰檢查均沒有明確的病原體檢出，只有1例患者在NGS結(jié)果報回后，血清GM試驗轉(zhuǎn)陽性，痰培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)有曲霉菌；還有一個共同特點是這4例患者之前均聯(lián)合使用多種抗生素和抗真菌藥物。NGS結(jié)果在BAL檢查的第2天報回后，所有4例患者的抗菌藥物均有重大調(diào)整，并且減少了無關(guān)抗菌藥物。在針對性的抗菌藥物調(diào)整后，這4例患者發(fā)熱等臨床癥狀消失，復(fù)查影像學(xué)發(fā)現(xiàn)原有異常好轉(zhuǎn)或者消失。從這4例患者的抗感染診療經(jīng)過中，我們可以發(fā)現(xiàn)NGS對于血液腫瘤患者的這類肺部感染有重要價值。雖然上述4個病例在BALF經(jīng)NGS明確病原體后，治療均取得了滿意的療效，但我們的報道仍有不足：(1)目前NGS病原檢測僅僅可能確定病原體，但抗菌藥物的敏感性是NGS無法檢測的，故其無法取代培養(yǎng)后藥敏檢測；(2)我們的病例數(shù)仍少，采取這一策略診治肺部感染的總體結(jié)果目前尚不清楚；(3)這4例患者均僅進行DNA的NGS檢測，而沒有進行RNA的檢測，故無法排除有同時合并RNA病毒感染的可能。

綜上所述，根據(jù)我們報道4例患者的臨床診療結(jié)果，提示對于血液腫瘤患者合并感染時，如果在經(jīng)過多線抗菌藥物治療后，病人出現(xiàn)新的肺部感染并且抗感染治療無效時，及早纖支鏡下取BALF進行NGS檢測，對明確肺部感染病原體和后續(xù)抗菌藥物的選擇，有重要的指導(dǎo)意義，這一診療策略有待進一步探索和完善。