LncRNA MALAT1在下咽鱗狀細胞癌中表達及臨床意義

王曉敏，王楠楠，蘇凱，武桂祥，馬士崟，李慧

下咽鱗狀細胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是上消化道粘膜引起的惡性腫瘤,占頭部和頸部所有鱗狀細胞癌的5%[1]。下咽組織解剖結(jié)構(gòu)特殊,暴露困難,該部位惡性腫瘤發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，且生物學(xué)特性惡劣,易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，故大多患者就診時往往已是晚期(Ⅲ期和IV期)，常常伴有局部或遠處轉(zhuǎn)移，故而預(yù)后不良[2]。近年來，下咽癌的治療模式已由手術(shù)為主的綜合治療轉(zhuǎn)變?yōu)橥椒呕?如腫瘤未控再行挽救性手術(shù))，雖然喉功能的保存率較以前提高，但其生存率并無明顯改變，5年期存活率僅為25%～40%[3]。因此，在分子水平上開展HSCC發(fā)生、發(fā)展機制的研究將有助于提高HSCC的診治水平。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1， MALAT-1) 屬于核內(nèi)保留RNA，主要通過與細胞核內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達調(diào)控[4]。其在多種正常組織中表達，而在多種腫瘤中表達明顯上升，并能促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[5]。研究[6]表明過表達MALAT-1通過激活ERK / MAPK、p53、Wnt / β-catenin等信號通路和細胞周期等途徑增加細胞增殖。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)，屬于MAPK家族，ERK主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活,激活的ERK信號能夠下調(diào)部分抗增殖或腫瘤抑制基因[7]。已有文獻報道MALAT-1在口腔鱗狀細胞癌患者高表達[8]以及在喉癌、下咽癌發(fā)展中的作用[9]，本課題組先前對MALAT-1在喉鱗狀細胞Hep-2細胞的增殖和遷移已有部分基礎(chǔ)研究[10]，但是在下咽癌中尚未有進一步研究。前期預(yù)實驗結(jié)果顯示下咽癌組織中MALAT-1高表達，我們推測在下咽癌中MALAT-1可能是促癌基因，并可能通過激活ERK / MAPK發(fā)揮重要作用。本研究旨在分析LncRNA MALAT-1及ERK蛋白在下咽癌患者中的表達及其兩者與臨床病理特征的關(guān)系，為HSCC的發(fā)病機制及預(yù)后因素提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2020年4月通過耳鼻咽喉科頭頸外科就診并接受手術(shù)治療的未經(jīng)放化療藥物治療的HSCC患者35例，選取手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本及同一患者癌旁下咽粘膜組織(距離腫瘤外緣>2 cm)，所有標(biāo)本經(jīng)病理科 2 位專業(yè)技術(shù)人員診斷后確診癌組織為HSCC，癌旁為下咽黏膜正常組織。將下咽鱗狀細胞癌組織設(shè)為觀察組，將癌旁組織設(shè)為對照組。隨訪時間從手術(shù)時間開始，截止2021年2月或死亡或失訪(電話隨訪)。研究過程符合我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗試劑與儀器 miRNeasy?Mini kit，miScriptRT kit和miScriptSYBRGreen PCR Kit由德國Qiagen 公司提供，引物序列由Qiangen公司設(shè)計合成，EliVisionTMplus試劑盒購于邁新生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒及其他試劑購于上海碧云天公司，ERK蛋白抗體購自美國CST公司。主要儀器有美國GE公司的NanoVueTM Plus 光度儀,美國ABI公司的Step One TM Real-Time PCR 儀。

1.3 下咽鱗狀細胞癌組織中總RNA的提取 依據(jù)miRNeasy?Mini Kit使用說明書提取細胞總miRNA,NanoVueTM Plus 光度儀檢測RNA濃度和純度,A260/A280 比值需在1.9～2.1。利用miScriptRT Kit逆轉(zhuǎn)錄RNA, 選擇GAPDH作為內(nèi)參, 引物序列如下:MALAT1:F: 5'-AGC GGA ACG AAT GTA ACT-3', R: 5'-TTG CCT ACC ACT CTA AGA TTG T-3'；GAPDH:F: 5'-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3'，R: 5'-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3'。依據(jù)miScript SYBR Green PCR Kit 說明書在ABI Step One TM Real-Time PCR 儀進行Q-PCR, 每組設(shè)3個復(fù)孔, 計算復(fù)孔的Ct平均值, 按照2-ΔΔCt相對定量計算公式得到相對定量結(jié)果。

1.4 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測ERK蛋白表達水平 下咽鱗狀細胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織的石蠟標(biāo)本按以下步驟處理：經(jīng)過4%中性甲醛溶液固定，切片4 μm，經(jīng)二甲苯溶液脫蠟和梯度濃度的乙醇溶液脫二甲苯至水洗；3 %H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；5～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的ERK一抗或一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37 ℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37 ℃孵育10～30 min；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃或室溫孵育10～30 min；PBS沖洗，5 min×3次；顯色劑顯色(DAB或AEC)，自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。陽性對照采用已知的陽性切片，空白對照采用同種屬的IgG代替。

1.5 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果參照參考文獻[7]的評分方法:0級，無染色；1級淺黃色，2級棕黃色，3級棕褐色。陽性細胞百分率分級：0級，陽性細胞<5%；1級，5%～25%;2級，25%～50%；3級≥50%。組織學(xué)評分=染色強度×陽性細胞百分率。0～3分為陰性，4～6分為陽性，7～9分為強陽性。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MALAT1 在觀察組和對照組中的表達 與對照組癌旁組織比較，下咽癌組織中LncRNA MALAT1的表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 觀察組和對照組中LncRNA MALAT1的表達水平比較

2.2 觀察組和對照組中ERK的表達 ERK蛋白陽性表達為棕褐色，主要顯色在細胞質(zhì)中(圖1)，其在癌組織中的陽性率為88.57%，高于癌旁組織的22.86%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

1A 正常喉癌旁組織中ERK陰性表達 1B 喉癌組織中ERK陽性表達，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移圖1 ERK蛋白在癌旁組織和癌組織中的免疫組化染色

表2 觀察組和對照組中ERK的表達水平比較

2.3 下咽癌組織中LncRNA MALAT1高表達與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 下咽鱗狀細胞癌組織中LncRNA MALAT1的表達水平與患者的性別、年齡、吸煙史和腫瘤直徑均無關(guān)(P>0.05),而與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 LncRNA MALAT1表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 下咽癌組織中ERK蛋白陽性表達水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 下咽鱗狀細胞癌組織中ERK蛋白的表達水平與患者年齡、吸煙史和腫瘤直徑等指標(biāo)無關(guān)(P>0.05),而與患者的性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等指標(biāo)有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 ERK表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 下咽癌組織中LncRNA MALAT1高表達和ERK蛋白的表達與患者預(yù)后的關(guān)系 下咽癌患者術(shù)后1～60個月，LncRNA MALAT1高表達及低表達的5年總生存率分別為22.9%(8/27)和75.00%(6/8)(見圖2)。ERK陽性和陰性患者的5年總生存率分別為 38.71%(12/31)和75.00%(3/4)(見圖3)，差異均具有顯著性意義(P<0.05)。

圖2 下咽癌患者組織LncRNA MALAT1表達生存曲線

圖3 下咽癌患者組織ERK表達生存曲線

3 討論

下咽鱗狀細胞癌占所有頭頸部癌癥的3%～5%，60%～85%的下咽癌患者在診斷時臨床分期達到III-IV期。因此盡管采用積極的多學(xué)科治療，下咽癌的預(yù)后都比較差。此外臨床陽性淋巴結(jié)出現(xiàn)率高，復(fù)發(fā)率高以及第二原發(fā)性腫瘤也可能導(dǎo)致預(yù)后不良[11]。因此，在分子水平上開展HSCC發(fā)生、發(fā)展機制的研究將有助于提高HSCC的診治水平。非編碼RNA(ncRNA)是一類新興的轉(zhuǎn)錄物，由基因組編碼，但大部分不翻譯成蛋白質(zhì)。盡管沒有翻譯，ncRNAs在多種細胞和生理功能中扮演著重要角色。特別是長鏈非編碼RNA(長度大于200 nt的ncRNA)在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動力學(xué)、基因表達、生長、分化和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[12]。研究[13]證實LncRNAs參與HSCC的進展，然而關(guān)于LncRNA MALAT1在下咽癌中的作用尚不明確。近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在多種腫瘤疾病中的生物學(xué)功能作用，有研究[14]表明，在胃癌、肝癌、食管癌等多種腫瘤中LncRNA MALAT1的過表達促進了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，此外，還有研究[15]證實LncRNA MALAT1過表達可以促進NSCLC中的上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞從而促進腦轉(zhuǎn)移瘤的形成。已有的研究[16]結(jié)果表明LncRNA MALAT1在喉癌、鼻咽癌、口腔癌和食管鱗狀細胞癌中上調(diào)，因此我們認為LncRNA MALAT1與下咽癌的進展有關(guān)。本研究通過RT-qPCR檢測觀察組和對照組中LncRNA MALAT1的表達水平，發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在下咽癌組織中高表達，并顯著高于癌旁組織，提示LncRNA MALAT1參與下咽癌的發(fā)生發(fā)展。通過分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1與下咽癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等指標(biāo)有關(guān)。進一步分析5年生存率發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1高表達的患者總生存率33.33%明顯低于低表達患者的75%，本資料結(jié)果提示LncRNA MALAT1高表達可能具有促進癌癥進程的作用并影響下咽癌患者的預(yù)后效果。

ERK屬于有絲分裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinase , MAPK)三大家族之一，主要由生長因子，例如表皮生長因子，(epidermal growth factor, EGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)激活, 調(diào)節(jié)有絲分裂信號，因此能夠通過磷酸化含有絲氨酸或者蘇氨酸磷酸化位點基序的特異性底物蛋白來控制細胞增殖、生存、分化和遷移。已有研究[17]表明在膠質(zhì)瘤中LncRNA MALAT1通過促進 P-ERK1/2 的表達水平，最終激活 ERK/MAPK 信號通路，發(fā)揮促進增膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲的功能。為了證實ERK在下咽癌中的作用，在本研究中，采用IHC檢測ERK的陽性表達，與對照組相比ERK在觀察組中表達水平明顯上調(diào)，ERK在觀察組中的陽性表達水平為88.57%顯著高于對照組22.86%。通過分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，ERK與淋巴結(jié)分期和TNM分期有關(guān)。此外，ERK陽性和陰性患者的5年總生存率分別為 38.71%和75.00%，表明ERK的高表達促進腫瘤組織的增殖、分化，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床預(yù)后較差。ERK表達量增高表明其可能通過是ERK/MAPK信號通路從而促進腫瘤的進程，與文獻報道的結(jié)果一致[17]。需要指出的是，我們的分析結(jié)果表明，ERK與患者性別也有關(guān)，造成這種結(jié)果的原因可能是本研究樣本中女性患者少，僅有1例，且ERK陽性占比高。由于本研究收集樣本的量較少，在下一步研究中，將擴大研究的樣本量，同時對下咽癌患者進行定期隨訪，以進一步分析LncRNA MALATl的表達值在下咽癌患者預(yù)后判斷中的意義。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LncRNA MALAT1和ERK蛋白均在下咽癌患者中表達顯著上調(diào)，并且其表達水平與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移指標(biāo)有關(guān)，筆者認為LncRNA MALATl對下咽癌早期診斷及療效監(jiān)測的潛在生物標(biāo)記物提供了理論基礎(chǔ)，同時對其作用與下咽癌的可能性機制進行了初步分析，未來需要明確LncRNA MALATl在下咽癌中與ERK作用的具體機制，為下咽癌治療提供依據(jù)。