高變異Y染色體短串聯(lián)重復片段檢驗體系的建立及對北方漢族群體調查

李運麗，宋誠誠，郝世誠，張金佩，劉 巖，徐 妍，袁 麗，3

（1.中國政法大學證據科學教育部重點實驗室，北京 100088；2.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；3.上海市法醫(yī)學重點實驗室∕∕司法部司法鑒定重點實驗室（司法鑒定科學研究院），上海 200063）

Y 染色體上的短串聯(lián)重復片段（short tandem repeat，STR）是父系遺傳關系鑒定和強奸案混合斑中男性個體識別的有效手段，是常染色體遺傳標記的重要補充［1-2］。隨著男性家系檢測的增多和YSTR數(shù)據庫的建立，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的Y-STR試劑由于低突變率常常不能有效區(qū)分不同男性家系［3］?？焖僮儺惖腨-STR（rapidly mutating Y-STR，突變率≥1.00×10-2）［4-5］有助于縮小偵查范圍、鎖定犯罪嫌疑人，是法醫(yī)DNA 領域新的研究、檢測方向。然而，在歐美白人中被定義為快速變異的Y-STR 基因座有的在中國人群中突變率并不高，并且個別基因座融入復合擴增難度大［6］。為了提升Y-STR 鑒別男性家系的能力，本研究篩查了既往研究報告中在我國群體突變率高的21個Y-STR基因座，建立五色熒光復合擴增體系，并對北方漢族群體進行調查，為高突變的Y-STR在父子間突變情況提供基礎性資料。

1 材料和方法

1.1 樣本

北方漢族健康男性無關個體志愿者500 人，每人及其兒子組成父子對500 對，經知情同意采集外周血，保存在FTA 卡上，父子關系均經“母-子-父”或“父-子”親子鑒定，親權指數(shù)均超過10 000。

1.2 方法

1.2.1 基因座的篩選 根據本實驗室以往研究結果［6］，從國外13個RMY-STR中選取在中國群體中突變率高的DYF399S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526b、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626 和DYS627 11 個基因座，另外，根據文獻篩選在中國民族群體突變率≥4.0×10-3具有高變異的9個Y-STR基因座［7-10］，包 括DYS390、DYS439、DYS456、DYS458、DYS460、DYS481、DYS549、DYS552 和DYS630 基因座。另外，本體系也納入了常用的DYS391 基因座，其在中國南方漢族人群［7］突變率為3.3×10-3。除了DYS481和DYS612系三核苷酸重復序列外，其他均為四核苷酸重復序列（表1）。

表1 篩選的Y-STR基因座及其基本信息Table 1 Selected Y-STR loci and their basic information

1.2.2 引物的設計與合成 在GeneBank 中查詢所選取的高變異Y-STR 基因座的基因序列信息，利用Primer 3 軟件（http：∕∕bioinfo.ut.ee∕primer3∕）設計引物，并利用UCSC（http：∕∕genome.ucsc.edu∕）中的BLAT軟件檢驗引物的特異性。根據各基因座核心序列情況設計其在體系中的位置，每對引物的前導鏈5'端分別標記6-FAM、HEX、TAMRA、ROX 熒光染料，內標選用橙色的ILS550，委托上海生工生物技術有限公司合成引物。

1.2.3 復合擴增體系的建立與引物優(yōu)化 PCR 體系中使用2×MasterMix（北京金馬晟和科技有限公司）緩沖液，內含Taq酶。在離心管中配置10 μL直擴體系，包含：2×MasterMix 4 μL，引物1～5 μL，用去離子水補足至10 μL。用0.5 mm 的打孔器對打孔1 片加入各個離心管中。PCR 熱循環(huán)參數(shù)設置為：95 ℃11 min、94 ℃10 s、59 ℃1 min、72 ℃30 s，27 個循環(huán)，60 ℃60 min，4 ℃保持，在9700 擴增儀（AB公司）上進行PCR反應。在PCR擴增體系中分別設置各個基因座的引物濃度，進行引物濃度優(yōu)化，使基因座之間的等位基因峰值達到平衡。

1.2.4 擴增片段的分離與檢測 PCR 擴增產物采用ABI 3130 型基因分析儀進行毛細管電泳分離。PCR 擴增產物1 μL、ILS 500 內標0.15 μL、Hi-DiTM‐Formamide 10 μL 混勻，加入自動進樣盤，編制進樣表，采用GM 模式電泳。電壓15 000 V、進樣 時間10 s，電泳30 min。電泳數(shù)據應用GeneMapper?IDX 1.4軟件分析，讀取等位基因的片段大小。

1.2.5 北方漢族群體及家系突變情況調查 采用本研究建立的21個Y-STR 基因座的五色熒光復合擴增體系，對500 對中國北方漢族父子樣本進行檢測。直接計數(shù)法統(tǒng)計突變個數(shù)，用突變個數(shù)除以父子對數(shù)獲得突變率，并利用二項概率分布計算95%的置信區(qū)間［11］。在500 名無關男性樣本群體中，用算式（Gene Diversity，GD）=n（1-ΣPi2）／（n-1）；Pi表示等位基因頻率，n代表樣本數(shù)。計算各基因座的基因多態(tài)性，觀察每個樣本是否存在相同的Y-STR單倍型。

2 結果

2.1 復合擴增體系的建立

本文成功設計了21對引物，建立了1個五色熒光復合擴增體系。在10 μL 直接擴增PCR 反應體系中，各基因座引物濃度優(yōu)化結果為：2.5 μmol∕L各基因座引物在0.18～0.50 μL 之間。根據優(yōu)化結果，21個Y-STR 基因座均得到有效擴增（圖1），擴增片段長度在90～370 bp之間，電泳圖譜顯示擴增效果好，各基因座之間及多拷貝等位基因之間的峰高基本平衡。除DYS612 為三核苷酸重復、stutter 峰略高外，其他基因座stutter 峰低于主峰的10%。根據DYS526a∕b 序列特點，設計一對引物僅擴增DYS526b基因座（圖2）。

圖1 21個Y-STR基因座復合擴增優(yōu)化圖譜Fig.1 A genotyping of a sample with 21 Y-STR Optimized amplification system

2.2 基因多態(tài)性結果

在500 個北方漢族無關個體中，本次建立的21個Y-STR 檢測體系，未發(fā)現(xiàn)有相同的單倍型?；蚨鄳B(tài)性結果請見表2。在一些多拷貝Y-STR 基因座上發(fā)現(xiàn)異常分型，見圖3-5。

2.3 父子突變率調查結果

500 個父子對中觀察到16 對出現(xiàn)2 個基因座的突變，1對出現(xiàn)3個基因座的突變，未發(fā)現(xiàn)有超過3 個基因座同時出現(xiàn)突變的情況。其他具體突變的情況見表2。

表2 21個Y-STR基因座在中國北方漢族群體的基因多樣性和突變率Table 2 Gene diversity and mutation rates of 21 Y-STRs in Han population of Northern China

3 討論

Ballantyne 等［12］通過系列研究表明13 個RM Y-STR 組合（DYS570、DYS576、DYS518、DYS526a∕b、DYS626、DYS627、DYS449、DYS547、DYS612、DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1 a∕b 和DYF404S1）無論在多態(tài)性還是個體識別能力方面均明顯強于當前常用的17 個Y-STR 的Yfiler 系統(tǒng)（美國AB 公司）。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)：①DYF387S1、DYF403S1b、DYS526a 在中國漢族群體突變率沒有到達快速變異基因座的標準；②DYF403S1a∕b 基因座單一引物擴增效率高、沒有雜峰，但只要與其它基因座復合擴增，產生很多非特異性產物，難以納入20 多個基因座的復合檢測體系中；③Ballantyne 等［12］公布的DYS526a∕b引物，其中一條引物能與DNA 模板的兩段序列結合（DYS526a引物與模板有兩個堿基的錯配），產生兩個最少相差180 bp的等位基因，由于錯配和大片段擴增缺乏優(yōu)勢的原因，DYS526a和DYS526b擴增效率都不高。鑒于DYS526b 基因座序列包含了DYS526a基因座，在本次體系構建中我們設計引物僅能檢測DYS526b 基因座（圖2），可提高其在復合擴增體系中擴增效率。本次納入復合擴增體系的基因座既要優(yōu)選在中國群體突變率高的，又要考慮復合擴增效率和減少非特異性峰的影響，最終建立的21 個Y-STR 五色熒光復合擴增體系，每個基因座均獲得了準確分型，復合體系擴增DNA 分型結果穩(wěn)定、均衡，具有種屬特異性。

圖2 DYS526a/b 基因座序列Fig.2 DYS526a/b Locus sequence

法醫(yī)學應用的Y-STR 基因座一般為單拷貝，但有少部分Y-STR 基因座為多拷貝。其原因是因為在Y 染色體重復回文區(qū)域有重復拷貝存在［13］或一對引物能與不同序列結合［14］產生多個等位基因。本體系中DYF404S1 為二拷貝基因座，DYF399S1為三拷貝基因座，相對于單拷貝Y-STR 基因座，多拷貝Y-STR 基因座具有較高的遺傳多態(tài)性，存在多個等位基因，有助于法醫(yī)學個人識別和親緣關系鑒定。然而，DYF404S1 和DYF399S1 會出現(xiàn)異常分型，在500 個無關男性樣本的DNA 分型圖譜中，DYF404S1 基因座上出現(xiàn)三等位基因14 例（圖3），DYF399S1基因座出現(xiàn)四等位基因10例（圖4）和五等位基因2 例（圖5），且有5 個樣本在這兩個基因座上同時出現(xiàn)稀有拷貝數(shù)等位基因分型。出現(xiàn)異常多等位基因DNA 分型提示在混合斑鑒定的案件中，對于嫌疑人數(shù)目的確定會存在困難，需結合其他檢驗結果綜合分析。

圖3 DYF404S1上出現(xiàn)三等位基因分型Fig.3 Distinctive tri-allelic pattern in DYF404S1

圖4 DYSF399S1上出現(xiàn)四等位基因分型Fig.4 Distinctive tetra-allelic pattern in DYSF399S1

圖5 DYSF399S1上出現(xiàn)五等位基因分型Fig.5 Distinctive five-allelic pattern in DYSF399S1

快速變異的Y-STR 基因座核心序列結構復雜、重復次數(shù)多，需要更多的空間來容納這些基因座，故而本文建立了五色熒光復合擴增體系，使用了6-FAM、HEX、TAMRA、ROX 和ILS550 熒光染料組合。根據在北方漢族人群中的調查結果，顯示21 個Y-STR 基因座的基因多態(tài)性除DYS391 為0.402 3外，其余20個Y-STR 在0.611 8以上，在500個無關男性個體中，未觀察到有相同單倍型的情況出現(xiàn)。在500 個父子對中大部分基因座的突變率遠高于常染色體STR 及目前法醫(yī)學常用的Y-STR基因座，突變率最高達到7.4×10-2，發(fā)生在DYF399S1 基因座上。觀察500 對北方漢族父子的21 個Y-STR 基因座DNA 分型圖譜，共出現(xiàn)134 次等位基因突變，其中一步突變出現(xiàn)127 次，兩步突變出現(xiàn)7 次，符合逐步突變機制。增加突變與減少突變數(shù)目相同，均為67 次。本次研究突變率≥1.00×10-2的12個Y-STR基因座中有10個基因座屬于復合或復雜核心序列，核心序列重復次數(shù)較多，體現(xiàn)了基因座的突變率受重復序列結構和等位基因重復次數(shù)的影響，重復序列結構復雜度越高、平均重復次數(shù)越多的基因座，突變率相對更高［15-16］。Ballantyne 等［4］提出重復區(qū)毗鄰的不可變序列長度對基因座的突變率有一定影響，不可變序列越長則會增加DNA 合成時復制滑脫的機會，本次研究中重復區(qū)毗鄰的不可變序列長度大于30 bp的基因座有9 個（DYF404S1、DYS439、DYS449、DYS518、DYS526b、DYS547、DYS552、DYS626 和DYS627），其中突變率≥6.00×10-3有8 個，驗證了上述理論。DYS630 和DYS390 基因座雖不在Ballantyne 等列出的RM Y-STR 之中，但在北方漢族群體中突變率達到快速變異標準。本研究在DYS391、DYS456基因座上未發(fā)生突變，而在南方漢族群體［7］中的突變率為3.3×10-3和4.4×10-3。另外，DYS549、DYS481、DYS552、DYS460 突變率接近Y-STR 的平均突變率，為2.0×10-3，分析可能是由于本次調查父子對樣本量的限制，同時也體現(xiàn)了Y-STR 突變率受不同地域、人群的差異的影響［17］。

應用這些高變異Y-STR 基因座進行法醫(yī)學親子鑒定及個人識別，更易于區(qū)分具有父系親緣關系的男性個體，有助于解決目前法醫(yī)學應用Y-STR基因座只能排除不能認定的瓶頸。但需要注意的是，由于高變異Y-STR 突變率較高，在親子鑒定中對有父系親緣關系的男性個體容易錯誤排除，故并不能完全取代現(xiàn)有Y-STR 試劑盒，但可以作為CO‐DIS 常染色體和常規(guī)低突變Y-STR 系統(tǒng)基因座的補充，具有良好的法醫(yī)應用價值。