大麻二酚通過激活PPAR-γ減輕四氯化碳所致小鼠急性肝損傷

舒遠輝，馬潤，謝娜，李垚，王豫萍，2△

肝損傷是一個多因素、多途徑、多靶點共同作用的結(jié)果［1-2］。短時間內(nèi)肝臟受到藥物、病毒、化學(xué)毒物大量刺激會引起急性肝損傷［3-4］。肝損傷可進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌等嚴(yán)重的肝臟疾病。因此，如何有效地預(yù)防和治療肝損傷，已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的焦點。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻（Cannabis Sativa）中含量最多的非成癮成分，患者即使長期使用仍具有良好的安全性［5-6］。研究證明，CBD對急性、慢性炎癥動物模型有治療效果［7-8］。CBD對氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的疾病如結(jié)腸炎［9］、糖尿病并發(fā)癥［10］、藥物誘導(dǎo)的腎毒性［11］、乙醇誘導(dǎo)的脂肪沉積癥或缺氧缺血引起的腦損傷等［12］具有治療作用。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在慢性過量乙醇飼養(yǎng)的小鼠酒精性肝損傷模型中，CBD可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)改善酒精性脂肪肝［13］。然而，CBD對化學(xué)毒物所致肝損傷是否也有保護作用目前尚未明確。本研究使用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，探討CBD對小鼠急性肝損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物42只雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量（22±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，批準(zhǔn)號：［SCXK（京）2016-0002］，小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，晝夜節(jié)律（12 h/12 h）相對恒定的環(huán)境中，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始建模。

1.2 主要試劑與儀器CBD、還原型谷胱甘肽（GSH）購自美國Sigma公司，CCl4購自中國Aladdin公司，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所，抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自英國Abcam公司，抗過氧化物增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）抗體、抗環(huán)氧合酶-2（COX-2）抗體購自中國萬類生物科技公司，全蛋白提取及BCA定量試劑盒購自中國北京索萊寶公司。ELX酶標(biāo)儀、全套電泳裝置購自美國Bio-Rad公司，超高速低溫離心機購自美國Beckman公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海培清有限公司。

1.3 動物分組和建模方法 將42只C57BL/6J雄性小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組：對照組（9只）、模型組（9只）、CBD對照組（9只）、GSH干預(yù)組（陽性對照組，6只）、CBD干預(yù)組（9只），其中CBD對照組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組分別腹腔注射CBD 5 mg/kg、GSH 200 mg/kg、CBD 5 mg/kg，對照組、模型組注射相同劑量的生理鹽水。2 h后模型組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組腹腔注射含20%CCl4橄欖油5 mL/kg建立急性肝損傷模型，對照組、CBD對照組注射相同劑量的橄欖油。禁食12 h，不禁水，造模24 h后麻醉小鼠，摘眼球取血，后頸椎脫臼處死小鼠，立刻冰上留取肝左葉，置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；同時肝右葉以4%多聚甲醛固定，并在3 d內(nèi)石蠟包埋、切片，準(zhǔn)備組織病理檢測。

1.4 指標(biāo)檢測與方法

1.4.1 肝組織HE染色檢測病理變化 將肝組織用4%多聚甲醛固定24 h后脫水處理，再行石蠟包埋，用切片機切取約4 μm厚的組織貼片，進行HE染色，光鏡下（×200）觀察肝組織的形態(tài)病理變化及損傷程度。

1.4.2 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測 將收集到的小鼠血液室溫靜置，至血塊自然收縮有血清析出，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，采用羅氏生化儀COBAS C501，按標(biāo)準(zhǔn)操作肌酸激酶測定（IFCC）法檢測血清ALT、比色法檢測血清AST。

1.4.3 肝組織勻漿檢測SOD、GSH、MDA水平 每組隨機抽取6只小鼠，取約100 mg肝組織，按照1∶9的比例加入生理鹽水，用勻漿器充分研磨制成10%的肝組織勻漿。采用酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按說明書的操作步驟，水溶性四唑鹽-1（WST-1）法檢測SOD、微板法檢測GSH、硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA。

1.4.4 Western blot法檢測肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白的表達 取約50 mg肝組織放入冰上預(yù)冷的研缽，加入液氮后快速研磨成粉末，再加入500 μL的RIPA裂解液和含1%蛋白酶抑制劑-苯甲基磺酰氟（PMSF），冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，上清液即所提蛋白。用BCA蛋白測定試劑盒按說明書測定蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和5×上樣緩沖液，使得各個樣本體系蛋白濃度相同，煮沸10 min后置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?0～40 μg之間，以相同的蛋白含量計算上樣體積，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗（TBST稀釋，GAPDH比例為1∶10 000，PPAR-γ為1∶1 000，COX-2為1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（TBST，1∶8 000稀釋）室溫孵育1 h，均勻滴加化學(xué)發(fā)光液（ECL）后在曝光儀上曝光，保存圖片用Image J進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25,P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBD對小鼠模型肝臟病理變化的影響 見圖1。HE染色顯示，對照組、CBD對照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)清晰，無明顯異常，細胞間無炎性細胞浸潤；模型組肝組織結(jié)構(gòu)模糊，肝索解離，細胞出現(xiàn)大面積的脂肪變性，局部點灶狀壞死；GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組肝組織結(jié)構(gòu)較為清晰，僅有小面積細胞水腫及少量炎性細胞浸潤。

Fig.1 Pathological changes in liver tissues of mice in five groups(HE staining,×200)圖1各組小鼠肝組織病理變化情況（HE染色，×200）

2.2 CBD對小鼠血清ALT、AST的影響 與對照組比較，模型組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組ALT、AST水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，CBD對照組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組ALT、AST水平均降低（P＜0.05）；與CBD對照組比較，GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組ALT、AST水平明顯升高（P＜0.05）；與GSH干預(yù)組比較，CBD干預(yù)組ALT水平無明顯變化（P＞0.05），AST水平降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum ALT and LST levels between five groups of mice表1 5組小鼠血清ALT、AST水平比較 ［M（P25，P75）］

2.3 CBD對小鼠肝組織勻漿中SOD、GSH、MDA水平的影響 與對照組比較，模型組SOD、GSH水平明顯降低，MDA水平明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，CBD對照組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組SOD、GSH水平明顯升高，MDA水平明顯降低（均P＜0.05）；與CBD對照組比較，GSH干預(yù)組MDA水平明顯升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of SOD,GSH and MDA levels in liver tissue homogenates between five groups of mice表2 5組小鼠肝組織勻漿中SOD、GSH、MDA水平比較（n=6）

2.4 CBD對小鼠肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白表達水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠肝組織PPAR-γ蛋白表達水平降低，COX-2蛋白表達水平升高（均P＜0.05）；與模型組比較，CBD對照組、GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組小鼠PPAR-γ蛋白表達水平升高，COX-2蛋白表達水平降低（均P＜0.05）；對照組、CBD對照組、GSH干預(yù)組與CBD干預(yù)組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Expressions of PPAR-γ and COX-2 proteins in liver tissues of mice detected by Western blot assay圖2 Western blot法檢測小鼠肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白的表達

Tab.3 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ and COX-2 protein in liver tissues between five groups of mice表3 5組小鼠肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白表達水平比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ and COX-2 protein in liver tissues between five groups of mice表3 5組小鼠肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白表達水平比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別PPAR-γCOX-2對照組1.17±0.090.55±0.14模型組0.60±0.07a0.98±0.19a CBD對照組1.27±0.18b0.41±0.07b GSH干預(yù)組1.11±0.09b0.54±0.10b CBD干預(yù)組1.09±0.28b0.58±0.12b F 7.672＊＊8.320＊＊

3 討論

肝臟是人體最大的器官，具有清除有害物質(zhì)、毒素的重要功能，但也易受生物、化學(xué)毒素的攻擊［14］。在關(guān)于肝損傷的研究中，CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷是經(jīng)典動物模型，其病理變化與人的肝臟病變有許多相似處［15］。AST和ALT是評估肝功能的敏感指標(biāo)，正常狀態(tài)下，ALT、AST主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，很少出現(xiàn)在血清中。ALT活性升高提示肝細胞受損，細胞膜通透性增強；AST活性升高提示線粒體損傷［16］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST水平較對照組明顯上升，結(jié)合病理結(jié)果，提示急性肝損傷模型建立成功；與模型組相比，GSH干預(yù)組、CBD干預(yù)組HE染色顯示肝損傷程度明顯減輕，血清ALT、AST水平降低，提示CBD對小鼠急性肝損傷具有一定的預(yù)防作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在CCl4所誘導(dǎo)的肝損傷中起主要作用，在肝臟中，CCl4在細胞色素P450（CYP450）的作用下，刺激NADPH氧化酶產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），突破GSH對ROS的防線，誘導(dǎo)自由基和脂質(zhì)過氧化，減少抗氧化酶和抗氧化底物，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］。大量累積的自由基與DNA分子中的嘌呤、嘧啶和脫氧核糖骨架反應(yīng)，破壞DNA結(jié)構(gòu)，生成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，大量MDA破壞肝細胞膜結(jié)構(gòu)，造成肝細胞腫脹壞死，機體抗氧化酶SOD活性下降，引起肝臟損傷［18］。因此，通過檢測組織中MDA、SOD、GSH水平可評價CCl4誘導(dǎo)的氧化損傷情況。本研究結(jié)果顯示，CCl4可導(dǎo)致肝臟MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，而CBD可明顯下調(diào)肝臟MDA水平，上調(diào)SOD、GSH水平，與Arbab等［19-20］的研究結(jié)果一致。因此，CBD對CCl4所致急性肝損傷的保護作用可能與提高肝組織抗氧化酶活性，減輕肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

為了進一步了解CBD預(yù)防CCl4急性肝損傷的機制，本研究采用Western blot法檢測了肝組織PPAR-γ、COX-2蛋白的表達。PPAR-γ是核激素受體超家族的成員，其參與細胞的分化、增殖、凋亡和細胞周期等相關(guān)生物過程的調(diào)控。COX-2是前列腺素生成的限速酶，其催化產(chǎn)生的前列腺素參與機體的炎癥反應(yīng)。有研究表明在相關(guān)肝病中PPAR-γ的活性受到抑制［21］，上調(diào)PPAR-γ能改善急性肺損傷中的炎癥反應(yīng)［22］。在脂肪性肝炎中，COX-2表達上調(diào)［23］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織PPAR-γ蛋白表達水平降低，COX-2蛋白表達水平升高；而CBD預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)了上述趨勢，提示CBD通過上調(diào)PPAR-γ的表達，進而發(fā)揮抗炎抗氧化的功能，在改善肝損傷的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，CBD能通過降低小鼠ALT、AST、MDA水平，減輕炎癥反應(yīng)并提高小鼠的抗氧化能力，改善CCl4致小鼠急性肝損傷，其機制與激活PPAR-γ、降低COX-2的表達有關(guān)，但其具體通路仍待進一步研究。