內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)冷凍保存大鼠坐骨神經(jīng)異體移植后神經(jīng)再生的作用

張松，黃英如，石一峰，劉云霄，冼華

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院針灸骨傷教研室，重慶市 400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市 400016

周圍神經(jīng)損傷常引起支配區(qū)域運動和感覺功能缺失，致殘率高。近年來，隨著基因治療和組織工程等技術(shù)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷的治療取得長足的進(jìn)步，但周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)與重建仍未取得突破[1-2]。自體神經(jīng)移植是臨床修復(fù)周圍神經(jīng)缺損(尤其是長段缺損)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在供區(qū)能滿足移植需要的神經(jīng)有限、造成新的失神經(jīng)損傷等缺點，限制了臨床應(yīng)用。同種異體神經(jīng)具有與自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu)，可以為周圍神經(jīng)缺損修復(fù)提供各種類型的神經(jīng)移植物；而周圍神經(jīng)冷凍保存，能夠為周圍神經(jīng)缺損提供充足的、即時需要的各種類型的神經(jīng)移植物，從而使同種異體神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)長段缺損成為可能[3-4]。

去細(xì)胞神經(jīng)移植物可體外長期保存，具有較低的免疫原性，異體移植后能支持受者神經(jīng)軸突再生[5-6]。施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，能合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTFs)和黏附分子，對周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生極為重要[7]。去除施萬細(xì)胞的周圍神經(jīng)，修復(fù)神經(jīng)缺損特別是長段神經(jīng)缺損后受者神經(jīng)再生能力可能有限[8-9]。有學(xué)者在去細(xì)胞神經(jīng)移植物中添加施萬細(xì)胞，異體移植后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)明顯優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體移植[10]。因此，周圍神經(jīng)冷凍保存時維持施萬細(xì)胞的生物活性，對神經(jīng)移植后的神經(jīng)再生具有積極作用。我們的前期研究證實[11]，周圍神經(jīng)冷凍保存能維持施萬細(xì)胞的生物活性，異體移植后的排斥反應(yīng)較弱，能支持移植后的神經(jīng)再生。

內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(endogenous neurotrophic factors,ENTFs)是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長、存活和分化的多肽類物質(zhì)，主要由施萬細(xì)胞合成和釋放，廣泛存在于動物體內(nèi)多種組織中[12]。周圍神經(jīng)損傷后，其遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性，施萬細(xì)胞失去與軸突的連接，在轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的作用下去分化，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写僭偕硇偷男迯?fù)施萬細(xì)胞，分泌大量活性增強(qiáng)的ENTFs，從而修復(fù)受損神經(jīng)元，加速軸突再生[13-15]。然而，在神經(jīng)移植后的局部微環(huán)境中，由于施萬細(xì)胞分泌的NTFs濃度過低，可能不足以維持神經(jīng)元胞體的存活和軸突再生，出現(xiàn)施萬細(xì)胞基底膜破壞，導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突長入困難甚至移植失敗[16-17]。

本研究體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)，模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性，誘導(dǎo)施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs，并觀察施萬細(xì)胞的凋亡情況和免疫原性變化，然后將表達(dá)ENTFs的周圍神經(jīng)冷凍保存，觀察冷凍保存后神經(jīng)的生物活性，及同種異體移植后對神經(jīng)再生的影響，以探討ENTFs促進(jìn)冷凍保存周圍神經(jīng)異體移植后神經(jīng)再生的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠138只，體質(zhì)量(200±20) g，重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0001。SPF級雌性Wistar大鼠153只，體質(zhì)量(200±20)g，成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細(xì)則》和重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的要求，所用動物實驗研究均嚴(yán)格按照動物福利與倫理原則處理。12 h黑白交替，相對濕度為65%～75%，室溫22～24 ℃。

1.2 試劑與儀器

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ、CD8單克隆抗體：美 國ABCAM公 司。Bcl-2、Bax、Caspase-3、MHC-Ⅰ單克隆抗體：美國AFFⅠNⅠTY公司。CD68單克隆抗體：美國NOVUS公司。β-actin單克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔ⅠgG二抗、山羊抗鼠ⅠgG二抗：美國EARTHOX公司。神經(jīng)絲(neurofilament,NF)200單 克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司。高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMSO：美國HYCLONE公司。雙抗(青霉素-鏈霉素)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。海藻糖：北京索萊寶科技有限公司。乙二醇：成都市科龍化工試劑廠。triton X-100：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Calcein-AM：日本東仁化學(xué)科技有限公司。碘化丙啶(propidium iodide,PⅠ)：武漢賽維爾生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。大鼠白細(xì)胞介素(interleukin,ⅠL)-2、干擾素(interferon,ⅠFN)-γ、腫 瘤 壞 死 因 子(tumor necrosis factor,TNF)-α ELⅠSA試劑盒：上海滬尚生物科技有限公司。

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：美國BⅠO-RAD公司。H-7500型透射電鏡：日本HⅠTACHⅠ公司。TCS-SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡：德國LEⅠCA公司。BL-420N機(jī)能實驗系統(tǒng)：成都泰盟。BX53正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。低溫高速離心機(jī)：德國SⅠGMA公司。

1.3 動物造模與分組

1.3.1 坐骨神經(jīng)取材及體外預(yù)處理

將138只Sprague-Dawley大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)取12只備用(9只作為移植階段供體大鼠，3只用作凍存后新鮮神經(jīng)對照組)，余126只2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)段15 mm，0.9% NaCl注射液沖洗，切取神經(jīng)后大鼠斷頸處死。隨機(jī)將252條坐骨神經(jīng)置于含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖型DMEM預(yù)處理液中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d (A組，n=42)、3 d (B組，n=42)、7 d (C組，n=42)、14 d (D組，n=42)和21 d(E組，n=42)，每2天換液，設(shè)置新鮮神經(jīng)對照組(F組，n=42)。

1.3.2 冷凍保存液配制、坐骨神經(jīng)冷凍保存及復(fù)溫

在高糖型DMEM溶液(含0.2 mol/L海藻糖、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素)中分別加入5%乙二醇和5%DMSO、10%乙二醇和10% DMSO、20%乙二醇和20%DMSO，配制成含5%、10%、20%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液。

將上述6組坐骨神經(jīng)依次分別置于含5%、10%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中室溫靜置各10 min，然后置于含20%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中，4 ℃放置30 min，-20 ℃放置1 h，-80 ℃放置1 h，最后將其置于液氮中保存4周。

坐骨神經(jīng)在液氮中保存4周后，置于37 ℃水浴鍋中復(fù)溫3 min，然后依次置于含10%、5%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中各10 min，最后置于高糖型DMEM溶液(含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素)中。

1.3.3 移植術(shù)受體分組及手術(shù)方法

健康成年SPF級雌性Wistar大鼠153只，其中144只作為受體大鼠，9只作為供體大鼠。另取上述9只Sprague-Dawley大鼠為供體大鼠。用上述冷凍保存后的A組、B組、C組、D組、E組、F組坐骨神經(jīng)(每組取18條)和9只Sprague-Dawley大鼠新鮮坐骨神經(jīng)(G組，n=18)修復(fù)對應(yīng)Wistar大鼠(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組、F′組、G′組)坐骨神經(jīng)10 mm缺損，設(shè)置Wistar大鼠同系移植對照組(H′組)，每組18只。

手法方法：受體大鼠術(shù)前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，剃毛，常規(guī)消毒、鋪巾，于右股后外側(cè)行斜行切口，沿肌間隙鈍性分離，暴露、游離坐骨神經(jīng)干，于梨狀肌下緣5 mm處整齊切除坐骨神經(jīng)造成10 mm缺損；將供體神經(jīng)段整齊修剪至10 mm，6倍手術(shù)顯微鏡下，以9-0帶線縫合針行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合4～6針，0.9%氯化鈉注射液沖洗術(shù)區(qū)，4-0縫合線逐層縫合，麻醉蘇醒后按組分籠飼養(yǎng)。手術(shù)均由同一人操作完成，術(shù)后大鼠均不做特殊處理。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 Western blotting

冷凍保存前，取各組神經(jīng)組織約30 mg (從18條坐骨神經(jīng)中取出)，剪碎，加入10 ml/kg裂解液，冰上裂解15 min，勻漿后4 ℃靜置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度。

上樣量100 μg，12% SDS-PAGE凝膠電泳，70 V電泳30 min后100 V電泳80 min，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，加一抗(GDNF 1∶5000；NGF 1∶10000；Bcl-2 1∶1000；Bax 1∶1000；Caspase-3 1∶1000；βactin 1∶5000；MHC-Ⅰ1∶2000；MHC-Ⅱ1∶1000；GAPDH 1∶5000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加相應(yīng)二 抗(山羊抗兔ⅠgG 1∶10000；山羊抗鼠ⅠgG 1∶10000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，GDNF、NGF、Bcl-2、Bax、Caspase-3以β-actin為內(nèi)參，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ以GAPDH為內(nèi)參；用Ⅰmage J軟件進(jìn)行定量分析，分別用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示蛋白的相對表達(dá)量。生物學(xué)重復(fù)6次。

1.4.2 冷凍保存后坐骨神經(jīng)生物活性

Calcein-AM/Propidium Ⅰodide熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍保存后坐骨神經(jīng)細(xì)胞存活與死亡情況。取上述冷凍保存4周后未用于移植的坐骨神經(jīng)，每組6條，復(fù)溫，另取上述備用3只Sprague-Dawley大鼠，切取坐骨神經(jīng)6條作為新鮮神經(jīng)對照組(G組)，剪切成長3 mm神經(jīng)段，室溫下1% triton X-100通透30 min，PBS緩沖液沖洗，Calcein-AM 20 μmol/L避光孵育30 min，PBS緩 沖液沖洗，Propidium Ⅰodide 100 μg/ml避光孵育15 min，PBS緩沖液避光沖洗，防熒光淬滅甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長490 nm (綠色熒光)和535 nm (紅色熒光)，活細(xì)胞呈綠色熒光，死細(xì)胞呈紅色熒光。

1.4.3 移植后一般情況

觀察移植后大鼠術(shù)口愈合、足趾潰瘍、移植側(cè)肌肉萎縮情況，取材時觀察移植神經(jīng)斷端吻合情況及粘連情況。

1.4.4 移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)

移植術(shù)后1周，每組選取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，于右股后外側(cè)原切口進(jìn)入，沿肌間隙鈍性分離，暴露、分離移植側(cè)坐骨神經(jīng)段，切取移植神經(jīng)段8 mm，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，縱切5 μm；脫蠟后，PBS緩沖液沖洗5 min×4次，山羊血清37 ℃封閉1 h，加一抗(CD81∶100；CD681∶100)孵育過夜，PBS緩沖液沖洗5 min，共4次，加相應(yīng)熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS緩沖液避光沖洗5 min，共4次，滴加防熒光淬滅甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

移植術(shù)后1周，上述大鼠截取移植神經(jīng)段后，心臟取血，室溫下靜置20 min后，3000 r/min離心20 min，取上清，ELⅠSA檢測ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平。

1.4.5 移植術(shù)后電生理檢測

移植術(shù)后20周，每組取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，于右股后外側(cè)原切口進(jìn)入，沿肌間隙鈍性分離，暴露、分離移植坐骨神經(jīng)段，于梨狀肌下緣3 mm處神經(jīng)干放置刺激電極，同側(cè)外踝關(guān)節(jié)上10 mm腓腸肌上放置接收電極，地線遠(yuǎn)離兩電極接地，刺激電流4 mA，刺激頻率1 Hz。用BL-420N生物信號采集與分析系統(tǒng)測定肌肉復(fù)合動作電位(compound muscle action potential,CMAP)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度(nerve conduction velocity,NCV)。

1.4.6 移植術(shù)后腓腸肌肌肉濕重比

電生理檢測后，完整剝離上述大鼠雙側(cè)腓腸肌，吸干其表面殘留液體并稱重，以自身非移植側(cè)作為對照，計算移植術(shù)后各組腓腸肌濕重比。

1.4.7 移植術(shù)后再生神經(jīng)NF200免疫熒光染色

電生理檢測后，切取上述大鼠移植神經(jīng)段8 mm，按照上述免疫熒光染色法(一抗NF200 1∶100)，熒光顯微鏡觀察移植神經(jīng)NF200熒光強(qiáng)度。

1.4.8 移植術(shù)后再生神經(jīng)組織學(xué)分析

移植術(shù)后20周，每組取6只大鼠，切取大鼠移植神經(jīng)段8 mm，2%戊二醛4 ℃固定過夜，1%鋨酸固定2 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋。半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，CCD光譜測量系統(tǒng)，每個樣本隨機(jī)選5張切片，每張切片隨機(jī)取5個視野，采用Ⅰmage-Pro Plus 6.0分析再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量；每組選取兩個樣本，超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，Ⅰmage-Pro Plus 6.0計算再生神經(jīng)髓鞘厚度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blotting

GDNF蛋白表達(dá)從高到低依次為：D組、C組/E組、A組(P＜0.05)；C組、D組和E組與F組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。NGF蛋白表達(dá)從高到低依次為：D組、C組、E組、A組(P＜0.05)；C組、D組和E組與F組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見圖1、表1。

圖1 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)GDNF、NGF蛋白表達(dá)

表1 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)GDNF、NGF蛋白表達(dá)

Bax蛋白表達(dá)從高到低依次為：E組、C組/D組、A組/B組(P＜0.05)；與F組相比，B組、C組、D組和E組表達(dá)均增加(P＜0.05)，A組與F組比較無顯著性差異(P ＞0.05)。Bcl-2蛋白表達(dá)從低到高依次為：D組/E組、C組、A組/B組(P＜0.05)；與F組相比，B組、C組、D組和E組表達(dá)下降(P＜0.05)，A組與F組比較無顯著性差異(P ＞0.05)。Bax/Bcl-2比值與Bax蛋白表達(dá)趨勢基本一致。Caspase-3蛋白表達(dá)從高到低依次為：D組/E組、B組/C組、A組(P＜0.05)；與F組相比，B組、C組、D組和E組表達(dá)增加(P＜0.05)，A組與F組比較無顯著性差異(P ＞0.05)。見圖2、表2。

在預(yù)處理組中，MHC-Ⅰ表達(dá)從低到高依次為D組/E組、B組/C組、A組(P＜0.05)；MHC-Ⅱ表達(dá)則為E組、D組、A組/B組(P＜0.05)。與F組相比，A組～E組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)均下降(P＜0.05)。見圖3、表3。

表2 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

圖3 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)

2.2 冷凍保存坐骨神經(jīng)細(xì)胞生物活性

G組神經(jīng)纖維綠色熒光強(qiáng)、分布廣泛，可見零星紅色熒光分布。A組～F組仍可見神經(jīng)纖維綠色熒光，但熒光強(qiáng)度較G組弱，紅色熒光較G組多。與F組相比，A組～E組綠色熒光強(qiáng)度減弱，紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，其中，A組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度最低，B組次之，C組、D組和E組最差。見圖4。

2.3 同種異體神經(jīng)移植后檢測

2.3.1 移植后一般情況

實驗期間大鼠無死亡，術(shù)后傷口無感染和壞死。同種異體移植術(shù)后1周，各組移植神經(jīng)段稍腫脹，與周圍組織無粘連。移植術(shù)后3周，各組右下肢肌肉出現(xiàn)不同程度的萎縮，除H′組外，其余各組(A′組4只、B′組4只、C′組3只、D′組2只、E′組2只、F′組5只、G′組5只)移植側(cè)出現(xiàn)足趾紅腫、潰瘍、缺失等改變，術(shù)后8～10周以后潰瘍陸續(xù)愈合。移植術(shù)后20周，各組移植神經(jīng)段與周圍組織均出現(xiàn)不同程度粘連，G′組粘連最重，F(xiàn)′組次之，H′組最輕，遠(yuǎn)近端吻合口稍膨大，無神經(jīng)瘤形成。

表3 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)

2.3.2 免疫排斥反應(yīng)

移植術(shù)后1周，H′組血清中ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平較低，G′組較高。與G′組相比，C′組、D′組、E′組ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平降低(P ＜0.05)。與F′組相比，C′組、D′組、E′組ⅠL-2水平降低(P ＜0.05)，E′組ⅠFN-γ 水平降低(P ＜0.05)，C′組、D′組、E′組TNF-α水平降低(P ＜0.05)，其他組間比較均無顯著性差異(P ＞0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組、E′組ⅠL-2水平較低，A′組、B′組、C′組較高(P ＜0.05)；各組間ⅠFN-γ 水平無顯著性差異(P ＞0.05)；D′組、E′組TNF-α 水平最低，C′組次之，A′、B′組最高(P ＜0.05)。見表4。

2.3.3 電生理檢測

H′組CMAP、NCV較優(yōu)，G′組和F′組較差，但D′組、H′組間和F′組、G′組間均無顯著性差異(P ＞0.05)。與F′組相比，B′組、C′組、D′組和E′組CMAP、NCV較優(yōu)(P ＜0.05)，A′組與F′組間無顯著性差異(P ＞0.05)；在預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組CMAP、NCV最優(yōu)，C′組和E′組次之，A′組和B′組最差(P ＜0.05)。見圖7、表5。

2.3.4 腓腸肌肌肉濕重比

H′組腓腸肌濕重比較高，G′組和F′組較低，但D′組與H′組間和F′組與G′組間均無顯著性差異(P ＞0.05)。與F′組相比，C′組、D′組和E′組腓腸肌濕重比較高(P ＜0.05)，但A′組、B′組、F′組間無顯著性差異(P ＞0.05)；在預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組腓腸肌濕重比最高，C′組、E′組次之，A′組、B′組最差(P ＜0.05)。見表6。

2.3.5 再生神經(jīng)NF200

H′組綠色熒光強(qiáng)度最高、分布均勻，G′組熒光強(qiáng)度最低、散在分布。與H′組相比，A′組～F′組綠色熒光較弱。與F′組相比，A′組～E′組綠色熒光較強(qiáng)；在各預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組綠色熒光強(qiáng)度最高、分布均勻，C′組次之，A′組和B′組最差。見圖8。

2.3.6 再生神經(jīng)組織學(xué)分析

H′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)最優(yōu)，G′組最差，但D′組和H′組間無顯著性差異(P ＞0.05)。與F′組相比，B′組、C′組、D′組和E′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)較多(P ＜0.05)，但A′組與F′組間無顯著性差異(P ＞0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)最多、分布均勻，C′組和E′組次之，A′組和B′組最差(P ＜0.05)。見圖9、表7。

H′組和D′組可見大量有髓神經(jīng)纖維，纖維粗細(xì)均勻，髓鞘厚；C′組和E′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較多，分布廣泛、髓鞘較厚；A′組和B′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較少，分布較廣泛，髓鞘較??；G′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量少，直徑細(xì)，髓鞘薄，分布稀疏。H′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度最優(yōu)，G′組最差，但D′組與H′組間無顯著性差異(P ＞0.05)。與F′組相比，B′組、C′組、D′組和E′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度較優(yōu)(P ＜0.05)，但A′組與F′組間無顯著性差異(P ＞0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中，D′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度最優(yōu)，C′組和E′組次之，A′組和B′最差(P ＜0.05)。見圖10、表7。

表4 移植術(shù)后1周，各組血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平(ng/L)

表5 移植術(shù)后20周各組CMAP和NCV比較

表6 移植術(shù)后20周各組腓腸肌濕重比

表7 移植術(shù)后20周各組軸突密度與髓鞘厚度比較

3 討論

自體神經(jīng)移植因來源有限、供區(qū)并發(fā)癥等缺點，不能滿足臨床對周圍神經(jīng)缺損，尤其是長段缺損修復(fù)的需要。同種異體神經(jīng)具有與自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu)，可能是自體神經(jīng)理想的替代物。周圍神經(jīng)冷凍保存可以為臨床提供神經(jīng)缺損修復(fù)所需要的神經(jīng)移植物，從而使同種異體神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)長段缺損成為可能[3-4]。

去細(xì)胞神經(jīng)具有低免疫原性，同時神經(jīng)內(nèi)部的三維支架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的活性成分得以保持，并且可以體外長期保存，異體移植后能支持受者神經(jīng)軸突再生[5-6]。有學(xué)者在去細(xì)胞神經(jīng)移植物中添加NTF，移植后的神經(jīng)再生優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體神經(jīng)移植[18]。然而，NTFs半衰期短，如何在去細(xì)胞移植物中長期穩(wěn)定釋放是運用的難點[19-20]。運用控釋技術(shù)將GDNF復(fù)合到去細(xì)胞神經(jīng)移植物中，GDNF的長期持續(xù)釋放促進(jìn)移植后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[21]。因此，NTFs的持久釋放對周圍神經(jīng)長段缺損修復(fù)后的軸突再生尤為重要。

施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，能合成和分泌多種NTFs和黏附分子，對周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生具有非常重要的作用[7]。有研究證實，在去細(xì)胞的神經(jīng)移植物中添加施萬細(xì)胞，術(shù)后受體神經(jīng)再生明顯優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體神經(jīng)移植[10]。因此，周圍神經(jīng)冷凍保存時維持施萬細(xì)胞的生物活性，對神經(jīng)移植后的神經(jīng)再生具有積極作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)冷凍保存能維持施萬細(xì)胞的生物活性，異體移植后的排斥反應(yīng)較弱，能支持移植后的神經(jīng)再生[11]。

本研究體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)，體外模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性，誘導(dǎo)施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs，然后將表達(dá)ENTFs的周圍神經(jīng)冷凍保存，最后將冷凍保存后的神經(jīng)進(jìn)行同種異體移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)能誘導(dǎo)其施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs；高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)Bcl-2表達(dá)下降，Bax、Caspase-3表達(dá)增加，Bax/Bcl-2比值增高，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)下降；高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周后，雖然存活施萬細(xì)胞數(shù)量減少，但同種異體移植后免疫反應(yīng)較弱，能促進(jìn)移植后受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。

圖4 各組坐骨神經(jīng)比較(Calcein-AM/Propidium Ⅰodide染色，激光共聚焦顯微鏡，×400，bar=50μm)

ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放，施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，在生理條件下經(jīng)逆向運輸ENTFs至神經(jīng)元胞體，提供營養(yǎng)支持，促進(jìn)神經(jīng)元成熟、分化[22]；周圍神經(jīng)損傷后，軸突、髓鞘崩解，其遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性，施萬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的作用下去分化，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写僭偕硇偷男迯?fù)施萬細(xì)胞，釋放大量ENTFs，如GDNF、NGF等，這些ENTFs在周圍神經(jīng)損傷后對施萬細(xì)胞的存活、軸突的生長和走向起著十分重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用[23-24]。GDNF能促進(jìn)運動神經(jīng)元的存活[25]；NGF能促進(jìn)感覺神經(jīng)元的存活[26]。然而，在同種異體神經(jīng)移植后的局部微環(huán)境中，由于施萬細(xì)胞分泌的NTFs濃度過低，可能不足以維持神經(jīng)元胞體的存活和軸突再生，出現(xiàn)施萬細(xì)胞基底膜破壞，導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突長入困難甚至移植失敗[16-17]。因此，促進(jìn)周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞分泌ENTFs可能會改善神經(jīng)異體移植后的軸突再生和功能恢復(fù)。

圖5 移植術(shù)后1周A′～D′組移植神經(jīng)段CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵情況(免疫熒光染色，×200)

本研究通過體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)不同時間，模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性，誘導(dǎo)其施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs，結(jié)果顯示，體外預(yù)處理7 d以上可促進(jìn)坐骨神經(jīng)ENTFs表達(dá)，以14 d效果最佳。隨后將預(yù)處理后表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周，同種異體移植修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損，結(jié)果顯示，表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多、髓鞘厚，CMAP高，NCV快，以預(yù)處理14 d效果最佳。

圖6 移植術(shù)后1周E′～H′組移植神經(jīng)段CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵情況(免疫熒光染色，×200)

ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放，施萬細(xì)胞的存活情況在一定程度上決定損傷周圍神經(jīng)的再生潛能。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的，Bcl-2、Bax與神經(jīng)元的存活關(guān)系密切，二者之間的比值決定細(xì)胞是凋亡還是存活[27]；而Caspase-3的激活在神經(jīng)元凋亡中起著極其重要的作用，被認(rèn)為是細(xì)胞死亡前的終末事件[28-29]。

圖7 移植術(shù)后20周各組CMAP波形

本研究檢測預(yù)處理神經(jīng)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與新鮮神經(jīng)對照組(F組)相比，坐骨神經(jīng)預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bax/Bcl-2比值升高。同時，我們還檢測Caspase-3蛋白表達(dá)，與新鮮神經(jīng)對照組(F組)相比，坐骨神經(jīng)預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Caspase-3表達(dá)也增強(qiáng)，這與Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2比值結(jié)果一致。將預(yù)處理坐骨神經(jīng)冷凍保存4周后，Calcein-AM/Propidium Ⅰodide熒光染色觀察保存后神經(jīng)的細(xì)胞存活情況，結(jié)果顯示，與新鮮神經(jīng)冷凍保存組(F組)、新鮮神經(jīng)組(G組)相比，各預(yù)處理冷凍保存組神經(jīng)纖維綠色熒光(代表活細(xì)胞)減弱，紅色熒光(代表死細(xì)胞)增強(qiáng)；在預(yù)處理冷凍保存組中，1 d組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度最低，3 d組次之，7 d組、14 d組、21 d組最差。這與預(yù)處理神經(jīng)施萬細(xì)胞凋亡情況一致。這些結(jié)果表明，預(yù)處理時間將影響坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞的存活。

圖8 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)NF200(免疫熒光染色，×400)

免疫排斥反應(yīng)是異體組織器官移植成功的關(guān)鍵。異體組織器官移植后的免疫反應(yīng)包括體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為細(xì)胞免疫應(yīng)答是同種異體神經(jīng)移植產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的主要機(jī)制，T細(xì)胞和T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞[30]?；罨腡細(xì)胞通過釋放ⅠL-2、ⅠFN-γ 和TNF-α 等炎性細(xì)胞因子募集和活化巨噬細(xì)胞，引起宿主炎性細(xì)胞浸潤和移植組織損傷[31]；而T細(xì)胞則可通過分泌穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺傷宿主靶細(xì)胞[32-33]。在移植免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞識別MHC-ⅠⅠ分子，而T細(xì)胞識別MHC-Ⅰ分子[34]，移植物MHC-Ⅰ、MHC-ⅠⅠ水平的高低在很大程度上決定移植后排斥反應(yīng)的強(qiáng)弱[35]。施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)，除了具有表達(dá)MHC-Ⅰ類分子外，還具有表達(dá)MHC-ⅠⅠ類分子的能力，是異體神經(jīng)移植后出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的主要原因[36]。

本研究檢測預(yù)處理神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達(dá)，結(jié)果顯示：各預(yù)處理組神經(jīng)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)均低于新鮮神經(jīng)對照組(F組)，表明預(yù)處理后的周圍神經(jīng)具有較低的免疫原性，這些神經(jīng)在冷凍保存后可能對減輕神經(jīng)異體移植后的排斥反應(yīng)具有重要的作用。同時，本研究還檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Bcl-2表達(dá)降低，Bax、Caspase-3表達(dá)均增加。預(yù)處理神經(jīng)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)下降可能與預(yù)處理過程中施萬細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。隨后，將預(yù)處理后表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周，預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組神經(jīng)的活細(xì)胞明顯低于新鮮神經(jīng)冷凍保存組(F組)和新鮮神經(jīng)組(G組)，這與預(yù)處理階段各組施萬細(xì)胞凋亡情況一致。最后，本研究觀察預(yù)處理冷凍保存的坐骨神經(jīng)異體移植后排斥反應(yīng)和受者神經(jīng)再生情況，結(jié)果顯示：移植術(shù)后1周，與新鮮神經(jīng)冷凍保存移植組(F′組)、同種異體新鮮移植組(G′組)相比，預(yù)處理冷凍保存移植組(A′～E′組)移植物中T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵及受者血清ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平較低，尤其是7 d移植組、14 d移植組和21 d移植組更低；移植術(shù)后20周，預(yù)處理冷凍保存移植組中7 d移植組、14 d移植組和21 d移植組受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)優(yōu)于新鮮神經(jīng)冷凍保存移植組(F′組)和同種異體新鮮移植組(G′組)。這些結(jié)果說明，冷凍保存后的具有較低免疫原性的預(yù)處理神經(jīng)，異體移植后受者排斥反應(yīng)降低，促進(jìn)了移植后受者神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。

圖9 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)(甲苯胺藍(lán)染色，bar=50 μm)

ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放，施萬細(xì)胞的活性在一定程度上決定周圍神經(jīng)移植物的再生潛能。然而，施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的主要表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原分子的細(xì)胞，是同種異體移植后出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的主要原因[37]。如果將周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞的活細(xì)胞控制在一定的范圍內(nèi)，則可能既降低周圍神經(jīng)免疫原性又保留其存活施萬細(xì)胞在異體移植后持續(xù)分泌ENTFs的能力，這對異體移植后的受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)具有重要意義。在本研究中，體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)成功地誘導(dǎo)其ENTFs表達(dá)，高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)雖然活細(xì)胞減少，但其免疫原性也下降，異體移植后排斥反應(yīng)降低，能促進(jìn)移植術(shù)后受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。然而，能高表達(dá)ENTFs的預(yù)處理坐骨神經(jīng)存活的施萬細(xì)胞卻減少，是因預(yù)處理時間較長導(dǎo)致坐骨神經(jīng)的存活施萬細(xì)胞減少，還是因預(yù)處理液中的營養(yǎng)成分不足以維持長時間體外培養(yǎng)過程中施萬細(xì)胞存活？還需進(jìn)一步研究并探討其可能機(jī)制和改進(jìn)措施。

圖10 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)(透射電鏡，×6000，bar=2 μm)