miR-7-5p通過調控POLE4對非小細胞肺癌細胞增殖侵襲的影響及作用機制

王富霞，姚菲菲，李增艷

0 引言

肺癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高。在所有肺癌患者中，85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1-3]。盡管治療NSCLC的臨床試驗有所進展，但結果仍然不盡如人意，患者的5年生存率僅有15%[4]。遠處轉移被認為是導致NSCLC治療失敗的最重要因素之一，研究涉及NSCLC轉移的關鍵分子對于新型有效的抗NSCLC治療至關重要[5]。微小RNA（miRNA）是一類高度保守的內源性表達的小型非編碼RNA，可能是腫瘤的啟動子或抑制子，在許多癌癥的轉移中起關鍵作用，包括胃癌、乳腺癌、肝細胞癌、膀胱癌和NSCLC等。MicroRNA-7（miR-7）是一種多功能的miRNA，在生理和病理狀況中發(fā)揮多種作用[6]。miR-7由miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3轉錄而成，都具有相同的成熟miRNA序列，miR-7-5p是該家族中研究最多的miRNA序列。研究表明，miR-7-5p在胃癌、結直腸癌和膠質母細胞瘤中具有抑癌作用[7-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p在腫瘤轉移中也發(fā)揮至關重要的作用[10]。POLE4蛋白是一種組蛋白折疊蛋白，與其他蛋白相互作用，以不依賴序列的方式結合DNA。在前期文獻調研中發(fā)現(xiàn)，POLE4是miR-7-5p的靶基因[11]。本研究擬探討miR-7-5p通過調控POLE4對NSCLC細胞增殖和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般臨床資料

收集2017年1月至2018年1月在鄭州人民醫(yī)院接受手術治療的54例NSCLC患者，其中男41例、女13例，年齡（56.2±7.4）歲?；颊咝g前均未接受化療或其他手術治療，收集患者的腫瘤組織及癌旁組織（距離腫瘤組織≥5 cm）。排除合并其他腫瘤、支氣管炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部相關疾病的患者。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗資料

非小細胞肺癌A549、NCI-H460、SPC-A-1細胞及正常人支氣管上皮細胞BEAS-2B均購于上海細胞生物學研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、結晶紫粉末、多聚甲醛、MTT粉末等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；陰性對照質粒（si-NC）、POLE4干擾質粒（si-POLE4）和miR-7-5p mimic質粒由北京華大基因研究中心有限公司合成；小室購于美國Corning公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR 收集組織和細胞樣品根據(jù)試劑盒說明書提取組織和細胞中的總RNA，反轉錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進行實時定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內參照。引物設計如下：POLE4上游引物序列5’-GGGTTCCCATAGACCTGGAC-3’，下游引物序列5’-CGCTCAGTAGTACCTGGGTAA-3’，miR-7-5p上游引物序列5’-GCGCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT-3’，下游引物序列5’-CTCAAGTGCTAGTCTGTAACTGGCTCAT-3’。GAPDH上游引物序列5’-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC-3’，下游引物序列5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及轉染 細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細胞密度生長到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行轉染實驗。SPC-A-1細胞以1×104個/孔的密度接種于6孔細胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，細胞融合度約為70%時，將對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞隨機分為對照組、si-NC組（陰性對照組）、si-POLE4組（轉染POLE4干擾質粒組），按照脂質體Lipofectamine 2000說明書步驟操作，轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，qRT-PCR檢測轉染效果。

1.3.3 雙螢光素酶報告基因實驗 以健康者DNA為模板，PCR擴增miR-7-5p與POLE4結合區(qū)域WT-3'-UTR和NFATC1-MUT-3'-UTR的DNA片段，將PCR產物分別與pMIR-REPORT luciferase報告載體分別用SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后純化、連接、轉化、鑒定，獲得POLE4的含WT-3'-UTR以及MUT-3'-UTR螢光素酶報告質粒。將其分別與miR-7-5p mimic共轉染SPC-A-1細胞48 h，按雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書在單光子檢測儀中檢測細胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性＝螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值（R/F）。

1.3.4 MTT實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，接種后每12 h檢測一次，每個檢測時間點設置6個平行孔，20 μl MTT溶液加入檢測孔中，放置恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h。去除上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，振蕩5 min使細胞充分裂解，酶標儀檢測570 nm處的吸光度值（OD），OD值與活細胞的數(shù)量成正比。

1.3.5 細胞遷移實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細胞以4×105個/孔的密度接種于培養(yǎng)皿中，放置恒溫箱中孵育24 h，用10 μl的槍頭從上至下劃痕，每個培養(yǎng)皿中劃5條，用PBS溶液將漂浮的細胞清洗掉，更換新鮮培養(yǎng)基，放置顯微鏡下拍照（此時劃痕的寬度記為a），之后放于恒溫箱中繼續(xù)孵育48 h，取出放置顯微鏡下拍照（此時劃痕的寬度記為b），細胞的遷移率=（a-b）/a×100%。

1.3.6 細胞侵襲實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，以5×103個/孔的密度接種于小室中，培養(yǎng)孔中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放置恒溫箱中孵育48 h。將小室取出放置多聚甲醛溶液中固定10 min，然后置于0.1%結晶紫溶液中染色10 min，用棉簽輕輕擦掉小室里未發(fā)生侵襲的細胞，放置顯微鏡下拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-7-5p和POLE4在NSCLC組織和細胞中的表達

miR-7-5p在NSCLC組織中的表達水平低于癌旁組織，miR-7-5p在A549、NCI-H460、SPC-A-1細胞中的表達水平低于人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B。POLE4在NSCLC組織中的表達水平高于癌旁組織，POLE4在A549、NCI-H460、SPC-A-1細胞中的表達水平高于人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B，見圖1。

圖1 miR-7-5p和POLE4在NSCLC組織和細胞中的表達水平Figure 1 Expression levels of miR-7-5p and POLE4 in NSCLC tissues and cells

2.2 miR-7-5p靶向結合POLE4

熒光素酶報告實驗結果表明，miR-7-5p mimic可減弱POLE4野生質粒熒光素酶活性，結合位點突變后，miR-7-5p mimic對POLE4突變質粒熒光素酶活性的抑制作用消失，miR-7-5p可靶向結合POLE4，見圖2。

圖2 miR-7-5p可靶向結合POLE4Figure 2 miR-7-5p could target POLE4

2.3 POLE4對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-NC和si-POLE4轉染至SPC-A-1細胞中，qRTPCR檢測si-POLE4組POLE4 mRNA的相對表達水平顯著低于對照組，而si-NC組POLE4的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，見圖3A。對照組、si-NC和si-POLE4組細胞培養(yǎng)72 h后，si-POLE4組細胞OD值顯著低于對照組和si-NC組，見圖3B。對照組、si-NC和si-POLE4組細胞培養(yǎng)48 h，細胞的遷移率分別為（70.4±2.1）%、（67.4±1.9）%、（40.9±2.4）%，si-POLE4組細胞的遷移率顯著低于對照組和si-NC組（t=16.371,P＜0.001;t=15.184,P＜0.001)，見圖3C。對照組、si-NC和si-POLE4組細胞培養(yǎng)48 h，發(fā)生侵襲的細胞數(shù)分別為（101.3±6.1）、（104.7±9.5）、（56.3±6.5），si-POLE4發(fā)生侵襲的細胞數(shù)顯著低于對照組和si-NC組（t=8.732,P＜0.001;t=7.296,P＜0.001），見圖3D。

圖3 POLE4對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 3 Effect of POLE4 on proliferation,migration and invasion of NSCLC cells

3 討論

隨著我國環(huán)境污染加重，人口老齡化增加，男性肺癌發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中位居第一，女性發(fā)病率僅次于乳腺癌[12]。腫瘤標志物檢查、支氣管鏡檢查、肺泡灌洗液檢查經皮穿刺肺活檢、胸腔積液檢查、痰脫落細胞學檢查等均為目前肺癌的常見診斷方法，但肺癌確診時大多處于中晚期階段，因此研究新的生物標志物用于肺癌早期診斷和治療具有重要的臨床意義。近年來，越來越多研究表明miRNA在細胞調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[13]，并在許多腫瘤中表達異常參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，被認為是基因表達的調控因子，發(fā)揮多種生物學功能[14]。目前已發(fā)現(xiàn)1 000多種miRNA，雖然占蛋白編碼基因的比例不足3%，但卻調控著30%以上蛋白編碼基因的表達。約50%的miRNA位于與腫瘤相關的脆性位點或區(qū)域，提示miRNA可能與腫瘤的發(fā)生有關。miRNA在外周血、組織、痰、胸腔積液、肺泡灌洗液中均穩(wěn)定表達且不易降解。在不同組織中miRNA的表達水平不同，在同一組織的不同病理狀態(tài)下其表達水平也不相同，這為NSCLC的早期診斷提供了可能。腫瘤細胞的侵襲和轉移是造成NSCLC患者5年生存率較低的主要原因之一，miRNA通過調節(jié)多種癌基因或抑癌基因在腫瘤轉移中起關鍵作用[15]。在NSCLC組織和細胞系中，miRNA-200a-3p的表達下調，與腫瘤大小、TNM分期和淋巴轉移有關，通過靶向IRS2調節(jié)NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。NSCLC組織和細胞中的miR-1296表達明顯下調，miR-1296的表達與NSCLC患者的淋巴結轉移和預后相關，通過調節(jié)Wnt信號通路轉導抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲[17]。miR-512-5p在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因作用，在組織中表達水平下調，通過靶向β-連環(huán)蛋白抑制細胞的增殖和侵襲[18]。

有研究顯示，miR-7-5p在抑制腫瘤進展中起關鍵作用，通過靶向不同基因抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[19]。miR-7-5p通過調節(jié)肝細胞癌和膠質母細胞瘤中的PI3K/Akt信號通路來抑制增殖和遷移[20]。miR-7-5p還可以通過靶向乳腺癌中的黏著斑激酶和Krüppel樣因子4來抑制細胞遷移[21]。miR-7-5p通過下調胃癌細胞中表皮生長因子受體的表達，抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[22]。本研究中，miR-7-5p在NSCLC組織和細胞中的表達水平均下調，而POLE4在NSCLC組織和細胞中的表達水平均有升高，經過熒光素酶報告進一步證實miR-7-5p可直接靶向POLE4蛋白的表達。運用質粒轉染技術將si-POLE4質粒轉染至NSCLC細胞中，使POLE4的表達水平降低，POLE4低表達組細胞的增殖、遷移和侵襲能力均減弱。

綜上所述，miR-7-5p在NSCLC組織和細胞中的表達水平均下調，可通過靶向POLE4抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲。miR-7-5p有望成為治療NSCLC的潛在靶點。