miR-325-3p靶向CLDN1基因調(diào)控胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移

杜記濤，曹建，趙穩(wěn)，萬相斌，李智

0 引言

作為起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌發(fā)病率在我國多種惡性腫瘤發(fā)病率中位居前三。受早期癥狀不明顯的影響，多數(shù)患者在就診時已處于晚期[1]。MicroRNA（miRNA）是一類長度約為20～25個核苷酸的內(nèi)生的非編碼RNA，被證實在人類多種癌癥中表達(dá)失調(diào)并且發(fā)揮促進(jìn)或抑制癌癥進(jìn)展的作用[2]。有研究表明miR-325-3p在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌因子的作用，能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[3]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)miR-325過表達(dá)能夠改善膀胱癌的化療耐藥[4]。Sun等在關(guān)于miR-325-3p和胃癌的研究時發(fā)現(xiàn)miR-325-5p在胃癌中表達(dá)下調(diào)并且能夠調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的耐藥[5]。緊密連接蛋白1（claudin 1,CLDN1）為緊密連接蛋白家族的一員，在結(jié)構(gòu)上為跨細(xì)胞膜蛋白，在不同組織和細(xì)胞中存在差異性表達(dá)[6]。據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CLDN1與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[7-8]。Eftang等[9]發(fā)現(xiàn)CLDN1表達(dá)增高與胃癌患者生存率降低有關(guān)。此外，CLDN1被證實在胃癌組織腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[10]。

本研究從影響胃癌進(jìn)展的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)角度出發(fā)，探究miR-325-3p/CLDN1在胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用機(jī)制，以期為胃癌的診斷和治療提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1以及人胃癌細(xì)胞株HGC27、SGC-7901、MKN-45和MGC-803購自中科院上海細(xì)胞庫；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Western blot實驗中抗體均購自英國ABCAM公司；pcDNA3.1（+）質(zhì)粒購自美國Addgene公司；PGL3基本載體購自美國Promega公司；高糖DMEM培養(yǎng)基及RPMI1640培養(yǎng)基均購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；熒光素酶試劑盒購自美國BioVision公司；Lipofectamine2000試劑盒、CCK-8試劑盒、Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國賽默飛世爾科技有限公司；細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；HBS-1096A酶標(biāo)儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將人胃黏膜細(xì)胞株GES-1以及人胃癌細(xì)胞株HGC27、SGC-7901、MKN-45和MGC-803培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中。qRT-PCR檢測miR-325-3p和CLDN1的表達(dá)，選取與miR-325-3p/CLDN1相關(guān)性最強(qiáng)的細(xì)胞株用于后續(xù)分組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個/毫升的濃度接種于6孔板中培養(yǎng)并分組：mimics NC組（轉(zhuǎn)染miRNA mimic陰性對照）、mimics miR-325-3p組（轉(zhuǎn)染miR-325-3p模擬物）、inhibitors NC組（轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor陰性對照）、inhibitors miR-325-3p組（轉(zhuǎn)染miR-325-3p inhibitor）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）、pcDNA-CLDN1組（轉(zhuǎn)染CLDN1過表達(dá)質(zhì)粒）、miR-325-3p+pcDNA組（轉(zhuǎn)染miR-325-3p mimic和空載質(zhì)粒）和miR-325-3p+pcDNACLDN1組（轉(zhuǎn)染miR-325-3p mimic和CLDN1過表達(dá)質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)Lipofectamine 2000（Invitrogen）試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 雙熒光素酶驗證miR-325-3p與CLDN1的靶向關(guān)系 運(yùn)用TargetScan靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站（http://www.targetscan.org/mamm_31/）預(yù)測miR-325-3p與CLDN1的結(jié)合位點。將含有miR-325-3p結(jié)合位點的CLDN1野生型（WT）序列或根據(jù)WT序列設(shè)計的突變體（MUT）序列擴(kuò)增后導(dǎo)入PGL3基本載體，命名為CLDN1-3’UTR-WT或CLDN1-3’UTRMUT。然后將正確測序的融合質(zhì)粒與NC或miR-325-3p共轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞。雙熒光素酶報告實驗驗證miR-325-3p和CLDN1的靶向關(guān)系，實驗步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。借助化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.3 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá) 按TRIzol試劑盒說明書提取胃癌細(xì)胞中總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，測定吸光度值鑒定RNA質(zhì)量和濃度后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并合成cDNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件和體系均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。所有序列由上海吉瑪基因公司設(shè)計并合成，miR-325-3p以U6為內(nèi)參，CLDN1以GAPDH為內(nèi)參。2-ΔΔCt法測定目的因子mRNA的表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞中加入1 ml細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min后提取總蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清液并借助BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。加入上樣緩沖液100℃煮沸5 min變性，取30 μg蛋白樣品上樣,SDS-PAGE凝膠電泳后濕式轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入一抗CLDN1、N-cadherin、Vimentin和MMP-2，4℃搖床孵育過夜，二抗采用山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。用ECL顯色液曝光，ImageJ軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 CCK-8測定細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞以3×105個每孔鋪于96孔板。分別在24、48和72 h時加入10 μl CCK-8試劑，37℃繼續(xù)孵育2 h，于450 nm處測量吸光度。

1.2.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 借助預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)基以1:10稀釋Matrigel膠，吸取100 μl充分混勻的Matrigel膠加入上室，37℃孵育Transwell小室4 h。將各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)并稀釋至5×105個/毫升后將200 μl細(xì)胞加入Transwell上室，下室加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。依據(jù)Transwell小室說明書行結(jié)晶紫染色，光鏡下隨機(jī)選取三個視野并計數(shù)跨膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 PBS洗滌細(xì)胞，以2 000 r/min離心5 min，加入500 μl結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/毫升，加入5 μl Annexin V-FITC并混勻，避光室溫溫育10 min。加入5 μl PI并混勻，于5 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。激發(fā)波長為480和530 nm檢測FITC，大于575 nm檢測PI。流式細(xì)胞儀顯示右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較使用post-hoc檢驗，不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGC-803細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)下降而CLDN1表達(dá)增強(qiáng)

使用dbDEMC2.0（https://www.picb.ac.cn/db-DEMC/index.html）和GEPIA（http://gepia.cancerpku.cn/detail.php）生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站查找miR-325-3p和CLDN1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-325-3p在胃癌組織中的表達(dá)較正常組織降低，CLDN1在胃癌組織中的表達(dá)是正常組織的50倍。qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于GES-1細(xì)胞，HGC27、SGC-7901、MKN-45和MGC803細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)被抑制而CLDN1表達(dá)增高（均P＜0.05），且MGC-803細(xì)胞的miR-325-3p表達(dá)最低，CLDN1表達(dá)最高，因此選擇MGC-803細(xì)胞用于后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 不同癌組織和細(xì)胞中miR-325-3p和CLDN1的表達(dá)Figure 1 Expression of miR-325-3p and CLDN1 in different cancer tissues and cell lines

2.2 CLDN1為miR-325-3p的靶基因

TargetScan靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站表明miR-325-3p與CLDN1存在特異結(jié)合位點，見圖2A，推斷CLDN1可能是miR-325-3p的靶基因。雙熒光素酶報告實驗進(jìn)一步證實，與NC組相比，miR-325-3p顯著抑制CLDN1-3’UTR-WT的熒光素酶活性（1±0.12vs.0.41±0.05,P=0.0014），而CLDN1-3’UTRMUT熒光素酶活性變化則不明顯（P＞0.05），見圖2B。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相對于mimics NC組，過表達(dá)miR-325-3p能夠顯著抑制CLDN1的mRNA表達(dá)（P＜0.05），見圖2C，而inhibitors miR-325-3p組CLDN1的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖2D。

圖2 miR-325-3p與CLDN1的靶向關(guān)系驗證Figure 2 Validation of targeting relation between miR-325-3p and CLDN1

2.3 過表達(dá)miR-325-3p可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖活力，而抑制miR-325-3p則相反

結(jié)果顯示，相較于mimics NC組，mimics miR-325-3p組細(xì)胞凋亡率顯著上升（6.21±0.51vs.14.17±1.21,P=0.0005）。而相較于inhibitors NC組，inhibitors miR-325-3p組細(xì)胞凋亡率顯著降低（6.69±0.62vs.3.21±0.33,P=0.0010），見圖3A～B。與mimics NC組在48和72 h時的細(xì)胞活力相比，mimics miR-325-3p組細(xì)胞增殖活力顯著降低（48 h:0.89±0.07vs.0.65±0.06,P=0.0107;72 h:1.13±0.11vs.0.86±0.09,P=0.0302）。而相較于inhibitors NC組，inhibitors miR-325-3p組細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)（0.85±0.09vs.1.14±0.13,P=0.0336;72 h:1.12±0.11vs.1.48±0.13,P=0.0216），見圖3C。

圖3 過表達(dá)miR-325-3p后各組細(xì)胞凋亡(A,B)和增殖(C)能力檢測結(jié)果Figure 3 Cell apoptosis(A,B) and proliferation(C) of each group after miR-325-3p was overexpressed

2.4 過表達(dá)miR-325-3p可抑制胃癌細(xì)胞侵襲和EMT而抑制miR-325-3p則相反

結(jié)果顯示，與mimics NC組比較，mimics miR-325-3p組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著減少（112±8vs.67±6,P=0.0015），EMT相關(guān)因子的mRNA（N-cadherin:1.78±0.15vs.1.25±0.11,P=0.0078;Vimentin:2.14±0.21vs.1.48±0.13,P=0.0098;MMP-2:1.89±0.17vs.1.34±0.12,P=0.0102）和蛋白表達(dá)（N-cadherin:1.25±0.10vs.0.83±0.07,P=0.0040;Vimentin:1.51±0.12vs.1.03±0.10,P=0.0060;MMP-2:1.37±0.11vs.0.94±0.08,P=0.0054）被抑制。相對于inhibitors NC組，inhibitors miR-325-3p組細(xì)胞侵襲數(shù)目增多（106±7vs.182±13,P=0.0009），EMT相關(guān)因子的mRNA（N-cadherin:1.79±0.15vs.2.36±0.19,P=0.0151;Vimentin:2.08±0.20vs.2.72±0.21,P=0.0187;MMP-2:1.83±0.18vs.2.45±0.20,P=0.0163）和蛋白表達(dá)（N-cadherin:1.28±0.12vs.1.64±0.13,P=0.0244;Vimentin:1.56±0.11vs.1.88±0.14,P=0.0358;MMP-2:1.35±0.14vs.1.72±0.13,P=0.0285）增強(qiáng)，見圖4。

圖4 過表達(dá)miR-325-3p后各組細(xì)胞侵襲能力(A)和EMT相關(guān)因子mRNA(B)及蛋白(C)的表達(dá)Figure 4 Cell invasion(A) and EMT-related factors mRNA(B) and protein(C) expression in each group after miR-325-3p was overexpressed

2.5 過表達(dá)CLDN1可逆轉(zhuǎn)miR-325-3p對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控

結(jié)果顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-CLDN1組細(xì)胞凋亡被抑制（6.58±0.62vs.3.22±0.31,P=0.0011），48和72 h細(xì)胞增殖活力（48 h:0.99±0.07vs.1.22±0.061,P=0.0124;72 h:1.26±0.11vs.1.54±0.12,P=0.0408）增強(qiáng)；而miR-325-3p+pcDNA組細(xì)胞凋亡增多（6.58±0.62vs.14.26±1.12,P=0.0005），48和72 h細(xì)胞增殖活力（48 h:0.64±0.05vs.0.95±0.09,P=0.0064;72 h:0.82±0.09vs.1.26±0.12,P=0.0071）被抑制。此外，miR-325-3p+pcDNA-CLDN1組與pcDNA組各指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05），表明CLDN1過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-325-3p對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，見圖5。

圖5 過表達(dá)CLDN1后各組細(xì)胞增殖(A,B)和凋亡(C)能力檢測結(jié)果Figure 5 Cell proliferation(A,B) and apoptosis(C) of each group after CLDN1 was overexpressed

2.6 過表達(dá)CLDN1可逆轉(zhuǎn)miR-325-3p對胃癌細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的調(diào)控

結(jié)果顯示，與pcDNA 組比較，pcDNACLDN1組細(xì)胞侵襲數(shù)目增多（114±10vs.174±15,P=0.0045），上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的mRNA（Ncadherin:1.68±0.16vs.2.15±0.21,P=0.0368;Vimentin:2.05±0.21vs.2.63±0.24,P=0.0345;MMP-2:1.81±0.16vs.2.30±0.21,P=0.0324）和蛋白表達(dá)（Ncadherin:1.19±0.10vs.1.60±0.14,P=0.0145;Vimentin:1.47±0.13vs.1.89±0.16,P=0.0243;MMP-2:1.30±0.11vs.1.71±0.15,P=0.0188）增強(qiáng)；而miR-325-3p+pcDNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目減少（114±10vs.59±5,P=0.0010）且上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的mRNA（N-cadherin:1.68±0.16vs.1.32±0.11,P=0.0325;Vimentin:2.05±0.21vs.1.51±0.14,P=0.0207;MMP-2:1.81±0.16vs.1.34±0.12,P=0.0152）和蛋白表達(dá)（N-cadherin:1.19±0.10vs.0.80±0.07,P=0.0052;Vimentin:1.47±0.13vs.1.03±0.09,P=0.0085;MMP-2:1.30±0.11vs.0.92±0.08,P=0.0084）被抑制。miR-325-3p+pcDNA-CLDN1組（123±12）與pcDNA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示CLDN1能夠逆轉(zhuǎn)miR-325-3p對胃癌細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，見圖6。

圖6 過表達(dá)CLDN1后各組細(xì)胞侵襲能力(A)和EMT相關(guān)因子mRNA(B)及蛋白(C)的表達(dá)Figure 6 Cell invasion(A) and EMT-related factors mRNA(B) and protein(C) expression in each group after CLDN1 was overexpressed

3 討論

本研究通過探討miR-325-3p在胃癌中的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-325-3p在胃癌組織中表達(dá)被抑制，同時能夠靶向CLDN1影響胃癌細(xì)胞的增長、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

CLDN1被認(rèn)為是維持細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的重要因子，有研究證實其與食管鱗癌、乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-12]。目前有研究認(rèn)為CLDN1的異常表達(dá)影響惡性腫瘤的侵襲性行為的具體機(jī)制在于其表達(dá)失調(diào)會破壞細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞間松散程度，促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲[13]。miRNA是自身并不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA分子，主要通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄后mRNA，抑制其翻譯或降解RNA進(jìn)而對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[14]。在關(guān)于CLDN1與胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CLDN1高表達(dá)預(yù)示患者較短的生存期[9]。表明CLDN1的表達(dá)與胃癌的惡性程度成正相關(guān)，因此我們選擇CLDN1表達(dá)最高的細(xì)胞系MGC-803用于后續(xù)實驗，而MGC803細(xì)胞中miR-325-3p在幾株胃癌細(xì)胞中表達(dá)被抑制最明顯，miR-325-3p與CLDN1的靶向關(guān)系也被驗證。

在檢測miR-325-3p/CLDN1調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為時，我們首先對胃癌細(xì)胞中miR-325-3p的表達(dá)進(jìn)行了干預(yù)，結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，過表達(dá)miR-325-3p能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡并且抑制其增殖和侵襲，抑制miR-325-3p表達(dá)效果則相反。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附以及極性等上皮表型特征并且轉(zhuǎn)化為高侵襲性、高遷移性的間質(zhì)細(xì)胞的過程[15]。有研究證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在多種癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[16-17]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是引起腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的重要原因，而MMP家族被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要因子[18]。在關(guān)于胰腺癌、乳腺癌、胃癌等的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-2在癌組織中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，能夠加速癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。本研究在探究miR-325-3p的作用時發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-325-3p能夠抑制N-cadherin、Vimentin和MMP-2的表達(dá)，即miR-325-3p對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響可能是通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子實現(xiàn)的。為進(jìn)一步研究miR-325-3p和CLDN1在胃癌調(diào)控中的關(guān)聯(lián)，我們將miR-325-3p和CLDN1共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-325-3p對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲的調(diào)控作用被CLDN1逆轉(zhuǎn)，即miR-325-3p對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響是通過靶向CLDN1實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-325-3p能夠靶向抑制CLDN1基因進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，過表達(dá)miR-325-3p能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有望成為胃癌治療的潛在靶點。但是對于miR-325-3p調(diào)節(jié)胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是否通過特定信號通路或轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)，本研究未做過多探討，這也是今后研究需關(guān)注的重點。