湖北省茶葉中吡咯里西啶生物堿污染概況及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

夏珍珍 彭茂民 鄭 丹 夏 虹 周有祥 彭立軍 王 清

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（武漢），湖北省農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.丹江口市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站，湖北丹江口 442700）

茶葉是在全球范圍內(nèi)廣泛飲用的飲品之一，茶葉及其飲用方式帶來的養(yǎng)生價(jià)值受到人們普遍關(guān)注。湖北是“茶祖”神農(nóng)、“茶圣”陸羽的故鄉(xiāng)，產(chǎn)茶歷史悠久，且擁有良好的氣候資源優(yōu)勢(shì)，屬于中國(guó)茶葉四大產(chǎn)區(qū)之一的江南產(chǎn)區(qū)[1～2]。目前，在湖北省內(nèi)形成了4個(gè)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，即鄂東北大別山產(chǎn)區(qū)、鄂西南武陵山產(chǎn)區(qū)、鄂西北秦巴山產(chǎn)區(qū)和鄂南幕阜山邊銷茶產(chǎn)區(qū)，且逐漸形成了涵蓋綠茶、紅茶、磚茶等的名優(yōu)茶品[3～4]。湖北的茶葉產(chǎn)區(qū)主要分布在山區(qū)，是湖北山區(qū)縣級(jí)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，也是山區(qū)解決勞動(dòng)力和鄉(xiāng)村振興的重要產(chǎn)業(yè)方向。茶葉是多年生木本植物，田間生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，在種植階段容易受到產(chǎn)地環(huán)境污染的影響，如環(huán)境水、土壤、空氣中的重金屬、有機(jī)污染物、毒素等有害物質(zhì)會(huì)通過葉片和根系的作用吸收進(jìn)入茶葉葉片，從而對(duì)最終的茶葉產(chǎn)品造成污染[5]。

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類由紫草科、菊科、豆科等植物產(chǎn)生的天然毒素，用于防御和抵抗昆蟲和食草動(dòng)物對(duì)其的侵害[6]。PAs具有的特殊結(jié)構(gòu)對(duì)動(dòng)物和人類有一定的毒性，侵害的毒性主要通過攝入含有PAs毒性的中草藥和受PAs污染的食物，包括蜂蜜、肉類、谷物、茶葉等[7～8]。攝入人體內(nèi)的PAs大部分通過腎臟和尿道排除，但是仍然有部分PAs會(huì)通過肝臟轉(zhuǎn)化從而跟體內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致肝毒性和遺傳毒性[9～10]。因此，關(guān)注暴露和不知情攝入PAs的情況具有重要的意義。

有研究表明，雖然茶葉本身并不屬于產(chǎn)生PAs的植物，但是茶園中的雜草中往往含有PAs，且會(huì)通過根系的作用從而污染茶葉葉片[11]。近年來，德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所發(fā)現(xiàn)德國(guó)市場(chǎng)上的部分茶葉中檢出PAs類生物堿，且部分樣品中含量高，雖然短期飲用不會(huì)造成急性健康風(fēng)險(xiǎn)，但是長(zhǎng)期的暴露則會(huì)存在健康風(fēng)險(xiǎn)[12]。目前，對(duì)于我國(guó)茶葉中PAs的暴露水平及其健康風(fēng)險(xiǎn)方向的研究較少，因而需要對(duì)我國(guó)茶葉中PAs的污染水平進(jìn)行調(diào)研分析?；诖耍x取湖北省主要的茶葉主產(chǎn)區(qū)，采集不同季節(jié)和不同種類的干制茶樣品，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）分析干制茶樣品中PAs含量水平，比較不同產(chǎn)地、不同茶葉種類、不同季節(jié)的茶葉中PAs含量間的差異變化，描繪湖北省茶葉中PAs的污染特征。另外，結(jié)合主產(chǎn)茶區(qū)茶園雜草的調(diào)研取樣分析，確定茶葉中PAs的可能污染來源和主要單一種類。最后，通過專門的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)其健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，為湖北省茶葉的PAs風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供支撐數(shù)據(jù)，為未來制定相應(yīng)的管控措施提供理論參考。

一、樣品采集及制備

（一）茶葉樣品的采集及制備選取湖北省5個(gè)茶葉產(chǎn)區(qū)開展茶葉（紅茶、綠茶和磚茶）中PAs的排查，共采集茶葉樣品89份，其中宜昌地區(qū)茶葉樣品49份（紅茶樣品41份、綠茶樣品8份）；恩施地區(qū)茶葉樣品10份（綠茶樣品5份、紅茶樣品5份）；咸寧磚茶樣品10份；英山綠茶樣品10份；大悟綠茶樣品10份。這批茶葉樣品又可依據(jù)采摘的季節(jié)不同將其細(xì)分為春、夏、秋茶3類。采集的干制茶通過高速中藥磨粉機(jī)進(jìn)行粉碎，過100目篩，后裝入自封袋4℃避光保存，以待檢測(cè)。

（二）雜草樣品的采集及制備選取茶園3處，采集茶園中主要雜草樣品，去除雜草根部和黃葉子，保留其他部分，切碎后用打碎機(jī)打成雜草漿，－18℃冷凍保存。

二、分析方法

（一）試劑與儀器共選擇了15種PAs，包括天芥菜堿（heliotrine，He）、天芥菜堿－N－氧化物（heliotrine－N－oxide，HeNO）、促黑激素（intermedine，Im）、促黑激素－N－氧化物（intermedine－N－oxide，ImNO）、千里光堿（jacobine，Jb）、千里光堿－N－氧化物（jacobine－N－oxide，JbNO）、倒千里光堿（retrorsine，Re）、倒千里光堿－N－氧化物（retrorsine－N－oxide，ReNO）、千里光寧堿（senecionine，Sc）、千里光寧堿－N－氧化物（senecionine－N－oxide，ScNO）、千里光菲靈堿（seneciphylline，Sp）、千里光菲靈堿－N－氧化物（seneciphylline－N－oxide，SpNO）、克氏千里光堿（senkirkin，Sk）、歐天芥菜堿（europine，Eu）、歐天芥菜堿N－氧化物（europine N－oxide，EuNO）。標(biāo)物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供，用乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）配置成10 mg/L的儲(chǔ)備液，4℃避光保存。濃硫酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）、甲酸（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）、氨水（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）、甲酸銨（優(yōu)級(jí)純，阿拉丁試劑公司）、PCX固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國(guó)安捷倫公司）、0.22μm水系針式過濾頭（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

UPLC－MS/MS，包括LC－30AD液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和Qtrap 4500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）。數(shù)據(jù)采集通過Analyst工作站，數(shù)據(jù)處理為MultiQuant分析軟件。ME－2002E 102型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器公司）、MS 3型渦旋儀（德國(guó)IKA公司）、TDL－5C臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、Milli－Q超純水處理儀（美國(guó)Millipore公司）、高速中藥磨粉機(jī)（濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司）。

（二）前處理方法PAs的分析方法參考文獻(xiàn)[13～14]，取1.00 g茶葉粉末或雜草漿于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，渦旋2 min，靜置過夜（或超聲15 min）提取，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中；殘?jiān)偌尤?0 mL 0.1 mol/L硫酸，超聲15 min，經(jīng)10 000 r/min離心10 min；將上述2次制備的上清液合并，取10 mL，待固相萃 ?。╯olid phase extraction，SPE）凈化。分別采用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化PCX SPE柱，再將上述待凈化的10 mL上清液分2次加入PCX SPE柱；待上清液的液面與SPE上層齊平時(shí)，分別采用5 mL去離子水（含1%甲酸）與5 mL甲醇進(jìn)行淋洗，再采用5 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脫；洗脫液經(jīng)0.22μm濾膜于UPLC－MS/MS自動(dòng)進(jìn)樣瓶，待UPLC－MS/MS分析。

（三）儀器方法色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm），流動(dòng)相A為1 mmol/L甲酸銨甲醇溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為1 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），洗脫梯度見表1。流速為0.25 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2μL。正離子電噴霧電離（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），MRM參數(shù)見表2。工作曲線的濃度范圍為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L，外標(biāo)法定量，采用同種類茶葉或同一科屬雜草配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

（四）數(shù)據(jù)分析分析茶葉中PAs的總量水平（最高值、最低值、中值、平均值和95%分位值），確定總體污染狀況，通過分析單一PAs檢出率和含量水平，確定主要污染成分。按不同茶類、不同產(chǎn)地和不同季節(jié)分析PAs總量和單一種類PAs的污染差異，比較茶葉中PAs污染水平和茶園中雜草PAs種類和含量相關(guān)性，分析茶葉中PAs的可能的雜草來源。通過Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin Pro 9.0繪制圖表。

三、結(jié)果與分析

（一）茶葉中PAs檢出基本情況

1.茶葉中PAs的檢出率、檢出種類和濃度分布范圍。分析89份茶葉樣品PAs的檢出率和檢出種類情況，發(fā)現(xiàn)89份茶葉樣品中，18份茶葉樣品中檢出PAs，湖北省茶葉樣品中PAs的整體檢出率為20.2%。其中檢出的濃度范圍在1.15～34.45 μg/kg，中 位 值4.02μg/kg，平 均 值7.78μg/kg，95%分 位 值 為27.47μg/kg。KALTNER等[13]和SCHULZ等[15]分析了德國(guó)市售的品牌花草茶，發(fā)現(xiàn)茶葉 中 的PAs的 含 量 范 圍 在0.3～253.4μg/kg。MATHON等[16]的研究表明瑞士品牌花草茶中PAs的含量在0.02～1.90μg/L。PICRON等[17]的研究表明比利時(shí)的茶葉中PAs含量范圍在43～113μg/kg。茶葉中的PAs污染問題已經(jīng)受到全球國(guó)家的關(guān)注，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，湖北茶葉中PAs的含量分布整體較低，德國(guó)和比利時(shí)茶葉中PAs污染水平較高，這也可能是因?yàn)楹钡牟枞~種類主要是紅茶、綠茶和磚茶為主，德國(guó)和比利時(shí)的茶葉以花草茶為主。

分析單一PAs的檢出情況可知，15種PAs中陽性檢出的包括Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk 6種，He、HeNO、Im、ImNO、Eu、Re、Sc、ScNO和SpNO共計(jì)9種未檢出。單一PAs的含量水平（最高值、最低值、中值和95%分位值）等統(tǒng) 計(jì) 信 息 見 表3。其 中，Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk單一PAs檢出率分別為1.1%、6.7%、2.2%、5.6%、2.2%和2.2%。比較發(fā)現(xiàn)，JbNO的檢出率最高，ReNO檢出率次之，EuNO、Sp和Sk檢出率相當(dāng)，位列第三，Jb的檢出率最低。6種單一PAs中，EuNO的平均含量最高，為16.53μg/kg。

表3 湖北茶葉中單一PAs統(tǒng)計(jì)情況

2.不同地區(qū)茶葉的檢出情況。分析湖北省5個(gè)茶葉產(chǎn)區(qū)（宜昌、恩施、咸寧、英山、大悟）茶葉樣品中PAs的檢出率情況得出，5個(gè)產(chǎn)區(qū)中僅宜昌、咸寧、大悟3個(gè)產(chǎn)區(qū)有檢出，檢出率分別為30.6%、20.0%和10.0%，宜昌地區(qū)茶葉中PAs檢出高出湖北省平均水平，恩施和英山的茶葉未檢出PAs。檢出產(chǎn)區(qū)的PAs分布情況見圖1。其中，宜昌地區(qū)的茶葉檢出PAs種類有7種，種類和頻次分別為Jb檢出2次、JbNO檢出6次、EuNO檢出1次、ReNO檢出7次、ScNO檢出6次、Sp檢出2次、Sk檢出7次。大悟地區(qū)的茶葉僅檢出EuNO，檢出1次。咸寧地區(qū)檢出3種PAs，種類和頻次分別為Sc檢出1次、ScNO檢出1次、Sk檢出6次。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)茶葉中PAs分布情況

3.不同茶葉種類的檢出情況。分析湖北省紅茶、綠茶和磚茶3類茶葉中的PAs情況發(fā)現(xiàn)，紅茶的檢出率為28.3%；磚茶的檢出率為20.0%；綠茶的檢出率為9.1%。與全省茶葉的整體情況相比，紅茶的PAs的檢出率高于全省茶葉的平均水平；磚茶與全省PAs的檢出水平相比，略低；綠茶的PAs檢出率要遠(yuǎn)低于全省茶葉的PAs的檢出率。不同種類茶葉PAs分布見圖2。有研究表明，不同茶類的茶葉中[13]，博士茶中PAs污染最為嚴(yán)重，其次是花草茶和紅茶，博士茶是一種草本茶類，易受茶園中雜草的污染。本文發(fā)現(xiàn)紅茶中PAs的污染率較綠茶和磚茶高，也與文獻(xiàn)中的發(fā)現(xiàn)較為一致。因而，按茶種類分，PAs的污染情況依次為博士茶>花草茶>紅茶>綠茶>磚茶。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)茶葉中PAs分布情況

分析各類茶葉中PAs的檢出種類和頻次情況發(fā)現(xiàn)，紅茶中檢出Jb 1次、JbNO 5次、EuNO 1次、ReNO 5次、ScNO 6次、Sp 2次、Sk 7次，共計(jì)7種。綠茶中檢出PAs共計(jì)4種，其中Jb、Jb-NO和EuNO檢出頻次各1次，ReNO檢出2次。磚茶檢出3種PAs，種類和頻次分別為Sc 1次、ScNO 1次、Sk 6次。

4.不同季節(jié)茶葉的檢出情況。從茶葉采摘的季節(jié)角度分析，發(fā)現(xiàn)春茶中PAs的檢出率為16.7%；夏茶中PAs的檢出率為30.4%；秋茶中PAs的檢出率為12.5%。其中，夏茶的檢出率水平要高于湖北省的平均水平，春茶和秋茶的檢出率要遠(yuǎn)低于平均水平。按茶葉種類分，檢出的PAs的含量分布情況見圖3。

圖3 不同季節(jié)茶葉中PAs分布情況

分析各季茶葉中PAs的檢出種類和頻次情況發(fā)現(xiàn)，春茶中檢出JbNO 3次、EuNO 1次、ReNO 3次、ScNO 4次、Sp 1次、Sk 4次，共計(jì)6種。夏茶中檢Jb 2次、JbNO 2次、ReNO 4次、ScNO 2次、Sp 1次、Sk 3次，共計(jì)6種。秋茶中檢出JbNO和EuNO各1次。

（二）茶園雜草中PAs檢出基本情況實(shí)地調(diào)查茶園中雜草情況，采集雜草樣品24份，共涉及雜草種類18種。通過對(duì)茶園雜草的PAs分析，雜草中PAs的檢出率為79.2%，平均值為3.871×103μg/kg，含量范圍為1.86～2.67×104μg/kg?？疾靻我籔As的檢出率，雜草中檢出的PAs共有12種，分別的檢出率分布見圖4。位于前三位的為JbNO、ReNO和ImNO，檢出率分別為58.3%、54.2%和25.0%，檢出平均值分別為1.72×103、2.65×103、1.56×103μg/kg，其他PAs的含量分布見表4。

表4 湖北茶園雜草中PAs統(tǒng)計(jì)情況

圖4 湖北茶園雜草中單一PAs檢出率分布

通過分析雜草種類，野葵花、烏蘞莓、藿香薊、野茼蒿、竹葉草、鵝腸草、狗尾草、牛膝菊、辣蓼、美洲商陸、牛筋草、馬唐、鴨跖草、夏堇、魚腥草、牛筋草這幾種雜草中都不同程度地檢出PAs。其中野茼蒿、烏蘞莓中的JbNO和ReNO二者含量較高；藿香薊、鴨跖草、鵝腸草中的ImNO含量較高。對(duì)比分析茶葉中PAs含量和雜草中PAs含量平均值，茶葉中PAs含量約為雜草中PAs含量的1‰左右，雜草中檢出率前兩位的PAs為JbNO、ReNO，與茶葉中檢出率前兩位的PAs種類一致。因而，雜草可能是茶葉的PAs的潛在來源之一。

（三）茶葉中PAs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估由于PAs具有一定的肝毒性、肺毒性、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性、致突性[18]，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）和歐盟均采用了暴露邊際（margin of exposure，MOE）法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估[19]。MOE的評(píng)估方法為：MOE=BMDL10/EDI，其中BMDL10為10%作用基準(zhǔn)劑量置信下限；EDI為茶葉中PAs的每日攝入量（estimated daily intake，EDI），茶葉膳食量以10.46 g計(jì)，該茶葉膳食量為2013年國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心通過非連續(xù)的“3天24小時(shí)”回顧方法，對(duì)我國(guó)9?。ㄊ校ū本┦?、黑龍江省、上海市、江西省、山東省、湖北省、廣東省、貴州省、甘肅?。┚用癫枞~消費(fèi)狀況調(diào)查得出的結(jié)果。體重以60.6 kg計(jì)[20]，PAs含量以單一PAs的總和計(jì)，含量取值95%分位點(diǎn)，即EDI＝95%分位點(diǎn)值×。當(dāng)MOE>10 000時(shí)，健康風(fēng)險(xiǎn)較低。目前歐盟和CAC分別制定了70μg/（kg bw·d）和237μg/（kg bw·d）的10%作用基準(zhǔn)劑量置信下限（BMDL10）[21]，根據(jù)歐盟和CAC的BMDL10值來計(jì)算不同產(chǎn)區(qū)、不同季節(jié)和不同茶類的MOE風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果見表5。從結(jié)果看，分別從整體、地區(qū)、季節(jié)和種類來評(píng)價(jià)，湖北省茶葉中的PAs健康風(fēng)險(xiǎn)較低。

表5 湖北茶葉中PAs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

四、結(jié)論

本文采用采用UPLC－MS/MS分析了湖北省地區(qū)的茶葉中PAs污染情況，并通過MOE方法評(píng)價(jià)了其健康風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明，雜草和茶葉中PAs的檢出率分別為79.2%和20.2%，PAs的總含量范圍分別為1.86～2.67×104μg/kg和1.15～34.45μg/kg。比較茶葉種類發(fā)現(xiàn)，紅茶中PAs的檢出率最高，磚茶次之，綠茶最低；比較5個(gè)茶葉主產(chǎn)區(qū)的PAs檢出率，PAs的檢出率依次為宜昌、咸寧、大悟（恩施、英山地區(qū)的茶葉未檢出PAs）；比較不同季節(jié)，依次為夏茶的檢出率最高，春茶次之，秋茶最低。根據(jù)MOE結(jié)果判斷，無論從產(chǎn)區(qū)、季節(jié)和種類角度評(píng)價(jià)，湖北省茶葉的PAs健康風(fēng)險(xiǎn)較低。通過茶園中雜草種類和PAs分析，發(fā)現(xiàn)雜草是茶葉中PAs的可能來源之一，但是其遷移途徑和轉(zhuǎn)化規(guī)律有待下一步研究。