γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)在老年肺結(jié)核篩選中價(jià)值研究

余美玲， 張雅惠， 黃 鶴

廣東省結(jié)核病控制中心 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510062

肺結(jié)核病發(fā)病和死亡數(shù)長(zhǎng)期居于我國(guó)甲類、乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静〉那傲衃1-3]。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化程度加劇，老年結(jié)核病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。老年人群為結(jié)核病患者的重點(diǎn)人群，但該人群對(duì)結(jié)核病的認(rèn)知有局限，且老年結(jié)核病患者臨床癥狀較為隱匿，常造成漏診、誤診，延誤最佳治療時(shí)間[4-6]。因此，在老年人群中積極推進(jìn)主動(dòng)篩查，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)被動(dòng)發(fā)現(xiàn)方式的不足，提高肺結(jié)核的檢出率。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，可產(chǎn)生特異性記憶T細(xì)胞，再次接觸結(jié)核分枝桿菌時(shí)可產(chǎn)生、分泌γ-干擾素，故可通過γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay,IGRA)來判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification，LAMP)利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，判斷靶基因是否存在[7-9]。兩種檢測(cè)方法均具有較好的診斷價(jià)值，但單獨(dú)檢測(cè)尚難滿足臨床需求，且存在爭(zhēng)議[10]。本研究對(duì)358例疑似肺結(jié)核的老年患者分別進(jìn)行IGRA檢測(cè)、LAMP檢測(cè)，探討兩種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用在篩查老年肺結(jié)核的價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2018年8月至2020年2月胸X線影像異?；蚺R床癥狀疑似肺結(jié)核的358例患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>60歲；具有疑似肺結(jié)核癥狀；有較好溝通能力。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期、哺乳期女性；胸部有外傷史或手術(shù)史；存在精神障礙者；臟器存在嚴(yán)重合并癥者。本組患者男性212例，女性146例；年齡60～83歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者了解本研究基本過程，愿意配合研究，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 患者均行胸X線影像檢查、痰液抗酸染色、痰液結(jié)核菌培養(yǎng)檢測(cè)、IGRA、LAMP，以臨床結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析IGRA聯(lián)合LAMP檢測(cè)在老年肺結(jié)核篩選中的價(jià)值。IGRA檢測(cè)：采集患者5 ml全血入真空抗凝管，分裝到本底對(duì)照管(N)、陽性對(duì)照管(P)和測(cè)試培養(yǎng)管(T)，每個(gè)管中均裝有刺激抗原，每管1 ml血液，采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒采用德國(guó)凱杰QuantiFERON?-TB(QFT)，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將培養(yǎng)管顛倒混勻后，立即放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)管保持直立；培養(yǎng)后以4 000 r/min 離心10 min，將血漿取出進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)光密度(optical density，OD)值計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。LAMP檢測(cè)：收集即時(shí)痰、夜間痰和次晨痰3個(gè)痰標(biāo)本，傳統(tǒng)檢測(cè)方法先進(jìn)行3個(gè)痰涂片檢查，根據(jù)痰的性狀和涂片結(jié)果陽性級(jí)別選取2份痰標(biāo)本，采用4%氫氧化鈉處理直接接種酸性羅氏培養(yǎng)基方法進(jìn)行痰培養(yǎng)檢查，再選取其中一份進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。將反應(yīng)管至于恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀器中的熒光檢測(cè)模塊，打開熒光開關(guān)進(jìn)行檢測(cè)。觀察樣品，若有熒光，則判定為陽性。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷及IGRA、LAMP檢測(cè)結(jié)果 358例疑似肺結(jié)核患者的臨床診斷結(jié)果顯示，163例患者為肺結(jié)核，195例患者排除肺結(jié)核。IGRA檢測(cè)結(jié)果顯示，121例患者為肺結(jié)核，237例患者排除肺結(jié)核。LAMP檢測(cè)結(jié)果顯示，68例患者為肺結(jié)核，290例患者排除肺結(jié)核。見表1。

表1 臨床診斷及IGRA、LAMP檢測(cè)結(jié)果/例

2.2 IGRA、LAMP診斷價(jià)值 IGRA診斷敏感度為84.30%、特異性為74.26%、準(zhǔn)確度為96.31%、陽性預(yù)測(cè)值為62.58%、陰性預(yù)測(cè)值為90.25%；LAMP診斷敏感度為91.18%、特異性為65.17%、準(zhǔn)確度為95.54%、陽性預(yù)測(cè)值為38.04%、陰性預(yù)測(cè)值為96.92%；IGRA聯(lián)合LAMP診斷敏感度為96.28%、特異性為83.25%、準(zhǔn)確度為98.16%、陽性預(yù)測(cè)值為70.56%、陰性預(yù)測(cè)值為98.23%。IGRA聯(lián)合LAMP診斷的特異性、陽性預(yù)測(cè)值均高于IGRA診斷、LAMP診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 IGRA、LAMP診斷價(jià)值/%

3 討論

有研究報(bào)道，在老年人群中開展肺結(jié)核病的主動(dòng)篩查，將極大地提高患者檢出率，但要檢測(cè)這種緩慢生長(zhǎng)的病原體，為臨床提供快速準(zhǔn)確病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果仍非常困難[3]。分子生物學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。IGRA已被世界衛(wèi)生組織宣布可作為肺結(jié)核潛伏感染的診斷試驗(yàn)，在肺結(jié)核診斷中靈敏度較高，特別是對(duì)于痰陰性肺結(jié)核患者，具有更高的診斷價(jià)值[11-12]。LAMP是以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),克服聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)需要熱循環(huán)設(shè)備價(jià)格高以及對(duì)操作人員技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，同時(shí)，該技術(shù)采用4個(gè)結(jié)核分枝桿菌特異性引物以識(shí)別目標(biāo)DNA上的6個(gè)不同的特異性區(qū)域，以縮短反應(yīng)時(shí)間并提高反應(yīng)的特異度及靈敏度[13]。LAMP檢測(cè)過程中不需要熱循環(huán)儀器進(jìn)行DNA擴(kuò)增，具有快速、特異、靈敏和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)和基層進(jìn)行快速檢測(cè)[14]。但目前關(guān)于IGRA、LAMP在基層肺結(jié)核篩查中應(yīng)用的研究報(bào)道較少。

本研究對(duì)358例疑似肺結(jié)核的老年患者分別進(jìn)行IGRA、LAMP檢測(cè)，并以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，358例疑似肺結(jié)核患者的臨床診斷結(jié)果顯示，163例患者為肺結(jié)核，195例患者排除肺結(jié)核。IGRA診斷敏感度為84.30%、特異性為74.26%、準(zhǔn)確度為96.31%、陽性預(yù)測(cè)值為62.58%、陰性預(yù)測(cè)值為90.25%；LAMP診斷敏感度為91.18%、特異性為65.17%、準(zhǔn)確度為95.54%、陽性預(yù)測(cè)值為38.04%、陰性預(yù)測(cè)值為96.92%；IGRA聯(lián)合LAMP診斷敏感度為96.28%、特異性為83.25%、準(zhǔn)確度為98.16%、陽性預(yù)測(cè)值為70.56%、陰性預(yù)測(cè)值為98.23%。IGRA聯(lián)合LAMP診斷的特異性、陽性預(yù)測(cè)值均高于IGRA診斷、LAMP診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明，IGRA、LAMP單一診斷的敏感度、準(zhǔn)確度和陰性預(yù)測(cè)值均較高，但是特異性、陽性預(yù)測(cè)值較低。二者聯(lián)合檢測(cè)診斷的價(jià)值明顯提升，分析其原因可能是因?yàn)镮GRA采用患者血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，有助于痰液陰性患者的檢測(cè)；而LAMP采用患者痰液樣本進(jìn)行檢測(cè)，以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)，即通過特異性引物結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的促旋酶B亞基基因,在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。此外，兩種檢測(cè)方法所用的血液樣本、痰液樣本均較易檢測(cè)，適合肺結(jié)核病的篩查。LAMP檢測(cè)是針對(duì)MTB的DNA為靶序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)死菌也表現(xiàn)為陽性。因此，LAMP檢測(cè)不能對(duì)臨床抗結(jié)核治療效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，且實(shí)驗(yàn)過程中DNA鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解，較高的成本可能會(huì)制約臨床應(yīng)用。

綜上所述，相較于單一檢測(cè)診斷，IGRA聯(lián)合LAMP診斷的特異性、陽性預(yù)測(cè)值更高，有助于老年肺結(jié)核篩選。目前，每種檢測(cè)肺結(jié)核的方法都存在一定弊端，仍需不斷研究相關(guān)檢測(cè)方法并加以改善，為肺結(jié)核的預(yù)防、治療評(píng)估等提供更可靠的方法。