循環(huán)外泌體微小RNA-10b表達及去甲基化狀態(tài)在診斷結直腸癌肝轉(zhuǎn)移及預測早期轉(zhuǎn)化治療反應中臨床價值

陳思敏， 唐詩宇， 張智彬， 王秋曉， 關麗娜， 唐學貴

川北醫(yī)學院肛腸疾病研究所，四川 南充 637000

消化道和盆腔腫瘤易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，這是腫瘤惡性發(fā)展的關鍵步驟，也是導致原發(fā)性腫瘤治療失敗的主要原因之一[1]。多數(shù)結直腸癌早期診斷率較低，常在發(fā)生肝轉(zhuǎn)移后才出現(xiàn)臨床癥狀，導致患者預后不良。因此，早期肝轉(zhuǎn)移的診斷和治療對原發(fā)性腫瘤的控制具有重要意義。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成為腫瘤細胞的血行擴散提供支持性的微環(huán)境，肝竇內(nèi)皮細胞在腫瘤細胞肝轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關鍵作用[2]。微小RNA-10b(microRNA-10b，miR-10b)在許多惡性腫瘤中表達上調(diào)，促進適宜腫瘤細胞遠處定植的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，從而介導腫瘤細胞發(fā)生肝組織特異性定植和轉(zhuǎn)移[3]。癌源性外泌體在肝轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮信號傳導的作用，為驗證miR-10b與結直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移的關系，筆者收集154例結直腸癌患者的血液樣本，提取循環(huán)血外泌體并檢測外泌體miR-10b的表達情況及去甲基化狀態(tài)，評估其作為肝轉(zhuǎn)移診斷和監(jiān)測早期轉(zhuǎn)化治療反應性的生物標志物的可能性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年1—12月收治的結直腸癌同時性肝轉(zhuǎn)移患者75例為肝轉(zhuǎn)移組，其中，男性52例，女性23例；年齡范圍39～76歲，年齡(57.28±10.64)歲。選取同時期在我院確診為結直腸癌且未合并任何臟器轉(zhuǎn)移患者75例為未轉(zhuǎn)移組(局灶性結直腸癌患者，臨床病理分期Ⅰ～Ⅲ期)，其中，男性48例，女性27例；年齡范圍32～78歲，年齡(56.31±12.43)歲。兩組的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：患者經(jīng)病理學診斷，確診為原發(fā)性結腸癌或直腸癌患者；經(jīng)CT引導下穿刺病理和(或)超聲、CT或 MRI資料隨訪證實，肝轉(zhuǎn)移組為同時性肝轉(zhuǎn)移癌患者，且具有可測量的肝轉(zhuǎn)移灶，未轉(zhuǎn)移組為未合并任保臟器轉(zhuǎn)移患者；血液樣本采集時均未接受過放療、化療、免疫治療、靶向治療或手術；肝轉(zhuǎn)移灶被評估為初始不可切除且接受轉(zhuǎn)化治療者，包括西妥昔單抗-FOLFOX4或西妥昔單抗-FOLFIRI一線化療方案。排除標準：原發(fā)性肝細胞癌、肝硬化患者或合并其他部位惡性腫瘤患者；合并其他器官轉(zhuǎn)移者；預計生存時間<3個月者。

1.3 研究方法

1.3.1 血清樣本獲取及處理 兩組患者在入院時采集外周血樣4 ml，收集血清樣本后立即通過離心法提取外泌體，并在-80℃下儲存在無RNase的Eppendorf管中直到使用。此外，取無外泌體血清標本設為陰性對照組。

1.3.2 提取外泌體 待血清樣本冷凍兩個月后，4℃下復溶，3 000 r/min離心15 min，丟棄細胞碎片。使用ExoQuick Exosome沉淀試劑(美國System Biosciences公司)從血清樣本中分離出外泌體。用透射電子顯微鏡(美國FEI公司)觀察外泌體形態(tài)。進行納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，得到所有樣品中的外泌體粒徑。用免疫印跡法檢測外泌體標志蛋白Alix、熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70、HSP90、Tsg101蛋白表達情況。一抗購自美國System Biosciences公司。

1.3.3 提取外泌體總RNA 采用miRCURYTMRNA提取試劑盒(丹麥Exiqon公司)提取外泌體總RNA，用200 μl去離子水重懸外泌體，加入60 μl裂解液，室溫下孵育3 min。12 000 r/min離心3 min。加入異丙醇，將樣品裝載到分離柱上，用去離子水洗脫3次。通過Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)和RNA 6000 Pico試劑盒(美國Agilent公司)對分離的RNA質(zhì)量進行測定。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應法測定外泌體miR-10b表達 使用qScript microRNA cDNA合成試劑盒(美國Quanta Bio Sciences公司)將150 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。首先，加入poly A加尾反應試劑，37℃ 60 min，70℃ 5 min。對于第一鏈cDNA合成反應，培養(yǎng)條件為42℃下20 min，85℃下5 min。使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix(美國Quanta BioSciences公司)在以下條件下進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應：1次循環(huán)，95℃ 2 min；40次循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 15 s，70℃ 15 s。所有反應均以一式三份的方式進行。miR-10b的表達水平使用小分子U6作為內(nèi)源性參考基因進行標準化。每個miRNA的相對表達用2-ΔΔCt方法計算。miRNA引物購自美國Quanta BioSciences公司。所有實驗引物均由Primer Blast 網(wǎng)站設計。miR-10b的正義鏈引物序列為5′-CCA GAG GTT GTA ACG TTG TCT-3′，反義鏈引物序列為5′-TGC ATC GAC CAT ATA TTC CCC T-3′，產(chǎn)物大小101 bp。小分子U6的正義鏈引物序列為5′-GCA GAC CGT TCG TCA ACC TA-3′，反義鏈引物序列為5′-AAT TCT GTT TGC GGT GCG TC-3′，產(chǎn)物大小149 bp。

1.3.5 miR-10b基因啟動子甲基化檢測 利用EZ DNA甲基化金試劑盒(美國Zymo公司)用亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化500 ng基因組DNA樣本。使用正向和反向生物素化引物(美國Sigma公司)擴增感興趣區(qū)域。選擇代表miR-10b的探針，與相應的miRNA表達呈最高的負相關。miR-10b甲基化引物序列：正義鏈引物序列為5′-GTA TTG TAT AGT GTT GAG GTG TTG G-3′，反義鏈引物序列為5′-ATC CAA ACT AAC CTC TCC ATT CCA C-3′。miR-10b非甲基化引物序列：正義鏈引物序列為5′-TAA GTA TTG TAT AGT GTC GAG GCG T-3′，反義鏈引物序列為5′-ATC CGA ACT AAC CTC TCC GTT CCG C-3′。按照試劑盒說明書(美國Zymo Research公司)采用PyroMark Q24系統(tǒng)(德國Qiagen公司)進行焦測序，包括甲基化和非甲基化DNA對照。

1.4 治療方法 根據(jù)國家癌癥綜合網(wǎng)絡[4]制定的指南，所有肝轉(zhuǎn)移患者接受西妥昔單抗-FOLFOX4或西妥昔單抗-FOLFIRI。FOLFOX4方案為：奧沙利鉑靜脈輸注85 mg/m2，靜脈輸注四氫葉酸鹽400 mg/m2，靜脈輸注5-氟尿嘧啶400 mg/m2；連續(xù)泵送5-氟尿嘧啶3 000 mg/m2超過46 h。FOLFIRI方案為：靜脈輸注伊立替康180 mg/m2，靜脈輸注四氫葉酸鹽200 mg/m2，靜脈輸注5-氟尿嘧啶400 mg/m2；連續(xù)泵送5-氟尿嘧啶3 000 mg/m2超過46 h。每個療程14 d。每天靜脈輸注西妥昔單抗500 mg/m2，每個療程14 d。共完成4個療程。所有患者均在化療前1周內(nèi)和化療結束后2～3周內(nèi)進行CT/MRI檢查。

1.5 療效評價 主要研究終點是達到客觀緩解的患者比例[5]。完全緩解指所有靶病變消失；部分緩解指基線病變的最大直徑總和減少至少30%；疾病進展指基線病變的最大直徑之和至少增加20%或出現(xiàn)新的病變。對于化療后未達到客觀緩解，也未觀察到疾病進展證據(jù)者，視為穩(wěn)定的疾病狀態(tài)。

2 結果

2.1 外泌體的形態(tài)特征、NTA分析及標志蛋白表達 通過透射電鏡觀察外泌體，結直腸癌患者血清外顯體多呈圓形、雙層膜囊泡狀結構；根據(jù)NTA分析，所描述的粒徑分布呈鐘形曲線，表明在90 nm處有1個峰值。經(jīng)免疫印跡法分析證實，與陰性對照組比較，未轉(zhuǎn)移組與肝轉(zhuǎn)移組血清外泌體相關標記物Alix、HSP70、HSP90、TSG101均高表達，說明提取的囊泡具有外泌體的典型特征，可用于后續(xù)研究。見圖1～2。

圖1 從結直腸癌患者血清中分離的外泌體特征(a.透射電鏡圖像顯示外體的特征結構，直徑約為90 nm；b.NTA測量的血清外顯體的大小分布，在90 nm處有1個峰值) 圖2 血清外泌體標記物Alix、HSP70、HSP90和TSG101表達水平

2.2 兩組患者血清外泌體中miR-10b相對表達量 肝轉(zhuǎn)移組患者血清外泌體miR-10b為(1.34±0.35)，顯著高于未轉(zhuǎn)移組的(1.00±0.17)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組患者血清外泌體miR-10b相對表達量

2.3 血清外泌體miR-10b對結直腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷價值 用ROC曲線對血清外泌體miR-10b用于肝轉(zhuǎn)移診斷的效能進行評價。ROC曲線下面積(area under curve，AUC)為0.787(95%可信區(qū)間0.713～0.860，P<0.001)。血清外泌體miR-10b診斷肝轉(zhuǎn)移的敏感度及特異度分別為91.50%、65.50%。見圖4。

圖4 血清外泌體miR-10b診斷肝轉(zhuǎn)移的ROC曲線

2.4 兩組患者血清外泌體miR-10b啟動子甲基化狀態(tài)差異 肝轉(zhuǎn)移組患者血清外泌體miR-10b基因啟動子甲基化率為30.7%(23/75)，低于未轉(zhuǎn)移組的74.7%(56/75)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。肝轉(zhuǎn)移組患者中，甲基化患者血清外泌體miR-10b相對表達量為(1.04±0.16)，顯著低于未甲基化患者的(1.47±0.32)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖5 兩組患者血清外泌體miR-10b甲基化狀態(tài)

圖6 肝轉(zhuǎn)移組miR-10b甲基化與未甲基化患者miR-10b表達情況

2.5 肝轉(zhuǎn)移組患者一線化療反應情況 所有患者均完成4個療程的化療方案，無患者完全緩解，34例患者部分緩解，24例患者出現(xiàn)疾病進展，17例患者疾病穩(wěn)定。將肝轉(zhuǎn)移患者分為治療有效組(部分緩解，34例)與無效組(疾病穩(wěn)定、疾病進展，41例)。治療有效組患者血清外泌體miR-10b相對表達量為(1.06±0.16)，低于無效組的(1.57±0.28)；治療有效組甲基化率為52.9%(18/34),高于無效組的12.2%(5/41)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.6 肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率影響因素分析 經(jīng)多因素Logistic回歸分析，多發(fā)轉(zhuǎn)移灶、肝葉侵犯、血清外泌體miR-10b甲基化是影響肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率的獨立因素(P<0.05)。見表1。

表1 肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率影響因素分析

2.7 血清外泌體miR-10b相對表達量對肝轉(zhuǎn)移患者一線化療獲得客觀緩解的早期預測價值 用ROC曲線對血清外泌體miR-10b用于肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率的預測效能進行評價， AUC為0.950(95%可信區(qū)間0.902～0.999，P<0.001)。血清外泌體miR-10b預測肝轉(zhuǎn)移患者一線化療后獲得客觀緩解的敏感度及特異度分別為93.50%、87.50%。見圖7。

圖7 血清外泌體miR-10b相對表達量預測肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率的ROC曲線

3 討論

本研究旨在探討外泌體miR-10b相對表達量和甲基化狀態(tài)與結直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移的關系，以評價其作為肝轉(zhuǎn)移診斷生物標志物以及用于預測一線化療反應性的臨床效能，從而有助于了解miR-10b在結直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移中的作用及為肝轉(zhuǎn)移的早期診斷提供新的線索和依據(jù)。本研究顯示，與未轉(zhuǎn)移組患者比較，肝轉(zhuǎn)移組患者血清外泌體miR-10b相對表達量升高，同時，基因啟動子甲基化率降低。此外，本研究納入的肝轉(zhuǎn)移患者均選擇西妥昔單抗-FOLFOX4或西妥昔單抗-FOLFIRI作為一線化療方案，完成4個療程化療后，治療有效組(獲得完全緩解或部分緩解)患者的治療前血清外泌體miR-10b相對表達量低于無效組，基因啟動子甲基化率較高；且經(jīng)多因素Logistic回歸分析，血清外泌體miR-10b基因啟動子甲基化是影響肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應率的獨立預測因素。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性發(fā)展的關鍵步驟，也是導致原發(fā)性腫瘤治療失敗的主要原因之一。多數(shù)癌細胞，特別是消化道腫瘤、盆腔腫瘤等，會優(yōu)先定植和轉(zhuǎn)移至肝。肝轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生率遠遠高于原發(fā)性肝細胞癌[6]。許多惡性腫瘤早期診斷率較低，常在肝轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)臨床癥狀，導致治愈率低。因此，早期肝轉(zhuǎn)移的診斷和治療對原發(fā)性腫瘤的控制具有重要的臨床意義。肝轉(zhuǎn)移的進展包括轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成和腫瘤的侵襲。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成為腫瘤細胞的擴散提供一個支持性的微環(huán)境，包括炎癥、免疫抑制、血管生成、血管通透性、淋巴管生成和器官向性等[7]。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的一系列事件為腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移和定植準備適宜的微環(huán)境，并支持這些轉(zhuǎn)移細胞的植入和存活。原發(fā)性腫瘤釋放的循環(huán)因子對于激發(fā)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能以及特異性靶器官定向轉(zhuǎn)移具有重要作用[8]。在這一階段，內(nèi)皮屏障被血管內(nèi)皮生長因子、活性氧、炎癥因子或花生四烯酸代謝產(chǎn)物的誘導所破壞[9]。然而，這一階段很難在臨床上評估。

血清外泌體因包含豐富的特異性蛋白、編碼RNA、小分子非編碼RNA等，參與腫瘤細胞肝轉(zhuǎn)移過程。miR-10b在多種類型惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。缺氧誘導因子-1ɑ能夠上調(diào)miR-10b表達，進而促進食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程[10]。啟動子低甲基化引起的miR-10b-3p表達上調(diào)有助于食管鱗狀細胞癌的進展，包括細胞增殖、克隆形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等。通過建立異種移植瘤模型研究結果顯示，miR-10b-3p表達量上調(diào)可促使模型裸小鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其下游靶點包括FOXO3蛋白，因此注射外源性miR-10b-3p拮抗劑可降低裸小鼠腫瘤生長速度和肝轉(zhuǎn)移風險[11]。有研究表明，miR-10b在轉(zhuǎn)移性結腸癌細胞系中表達上調(diào)，抑制miR-10b通過誘導細胞周期阻滯和凋亡來阻止癌細胞的轉(zhuǎn)移和生長[12]。KLF4是miR-10b的直接靶點，miR-10b抑制劑導致E-鈣粘蛋白表達上調(diào)和細胞周期蛋白D1下調(diào)，沉默KLF4后細胞周期蛋白D1表達被部分抑制[13]。本研究證實，肝轉(zhuǎn)移組患者血清外泌體miR-10b相對表達量低于未轉(zhuǎn)移組患者，且基因啟動子甲基化率降低，兩者具有負一致性，說明肝轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miR-10b表達量下降與基因發(fā)生去甲基化有關。且有研究證實，血清外泌體比原發(fā)性腫瘤細胞更早到達肝，在腫瘤細胞與其微環(huán)境之間傳遞信息，在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中具有重要作用[14]。血清外泌體具有3個主要特點：高靈敏度，外泌體能實時反映原發(fā)細胞的狀態(tài)；穩(wěn)定性，外泌體能抵抗循環(huán)的核糖核酸酶和蛋白酶的降解；高濃縮，外泌體可以被釋放到生物液中，為識別腫瘤患者提供一種無創(chuàng)的方法[15]。本研究通過ROC曲線分析證實，血清外泌體miR-10b可用于結直腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床診斷。

血清外泌體miR-10b除具有診斷肝轉(zhuǎn)移的潛力以外，還與肝轉(zhuǎn)移患者一線化療反應有一定的關系。治療有效組患者血清外泌體miR-10b表達明顯低于無效組，說明miR-10b與化療藥物反應性和耐藥性也有一定的關聯(lián)，miR-10b有望成為預測結直腸癌肝轉(zhuǎn)移者化療敏感性的潛在指標，但其在預測患者長期預后方面的價值仍有待確定。經(jīng)多因素Logistic回歸分析證實，血清外泌體miR-10b基因啟動子甲基化是肝轉(zhuǎn)移患者化療敏感的獨立影響因素，結合基因甲基化狀態(tài)是影響miR-10b表達量下調(diào)的重要原因，故筆者認為血清外泌體miR-10b相對表達量結直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者一線化療的療效有較高的預測價值。

綜上所述，結直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miR-10b相對表達量上調(diào)，且其在肝轉(zhuǎn)移的診斷方面具有一定潛力。此外，外泌體也是治療肝轉(zhuǎn)移的理想候選物，外泌體miR-10b基因啟動子甲基化是影響肝轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)化治療反應性的獨立影響因素，檢測血清外泌體miR-10b相對表達量有望為早期預測肝轉(zhuǎn)移患者的化療敏感性提供一定的參考價值，有助于臨床制定個體化治療方案。