原料乳中產(chǎn)蛋白酶假單胞菌雙重PCR檢測體系建立和評價

吳天賜，李楠，張娟，余意，劉振民*

1(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)中心，上海，200436)2(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海，200444)

假單胞菌是原料乳中普遍存在的嗜冷菌菌群，因其能在低溫條件下正常生長繁殖，產(chǎn)生耐熱蛋白酶和耐熱脂肪酶，被認(rèn)為是原料乳中具有極大危害性的菌群之一[1-3]。假單胞菌所產(chǎn)的堿性金屬蛋白酶(alkaline metalloproteinase)是其中一種常見的耐熱胞外蛋白酶，這種酶受到aprX基因的調(diào)控且無法通過巴氏殺菌和超高溫滅菌完全滅活，可導(dǎo)致乳制品在貨架期內(nèi)出現(xiàn)凝乳、發(fā)苦等[4]。隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)多類假單胞菌中存在相同或類似的蛋白酶基因，這些假單胞菌對原料乳及乳制品存在一定的潛在危害[5-7]。

我國對于原料乳中嗜冷假單胞菌的檢測方法依賴于傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法[8]，主要根據(jù)理化性質(zhì)來判斷，此方法存在檢測周期長、重復(fù)性不好和容易漏檢等缺點(diǎn)，很容易錯過檢測的最佳時期。PCR檢測技術(shù)因其快速、高效等特點(diǎn)已經(jīng)被運(yùn)用于食品中危害性微生物的檢測。將16S rRNA[9]和rpob基因[10]等作為特異性靶點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測假單胞菌已被廣泛報道。sucD基因是琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基編碼基因[11]，以sucD基因作為靶點(diǎn)檢測假單胞菌的研究非常少。研究[12]發(fā)現(xiàn)sucD基因在假單胞菌屬內(nèi)存在較高的同源性，可作為假單胞菌檢測靶點(diǎn)。此外，MARCHAND等[13]研究表明將aprX基因作為靶點(diǎn)能夠穩(wěn)定可靠的檢測假單胞菌。

多重PCR技術(shù)是PCR技術(shù)的一種，在一個反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，可同時針對多個靶點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增[14]。因為多重PCR與常規(guī)單一PCR相比，具有省時、低成本和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)等領(lǐng)域的檢測都已得到廣泛的運(yùn)用[15-17]。隨著我國乳制品行業(yè)引入冷鏈系統(tǒng)后，假單胞菌類嗜冷菌對原料乳的危害越發(fā)明顯，但遲遲沒有合適的解決方案。本研究將致力于針對2個目的基因，建立一種能夠快速檢測原料乳中具有產(chǎn)蛋白酶能力假單胞菌的雙重PCR檢測方法，并對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化和評價。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實驗所用菌株見表1，菌株均為-80 ℃甘油保存。

表1 實驗菌株Table 1 Strains used in the study

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒，天根生化科技有限公司；100 bp DNA Marker以及TaqDNA聚合酶等PCR反應(yīng)試劑，Takara；酵母提取物，阿法埃莎(Alfa Aesar)化學(xué)有限公司；牛肉膏，上海盛思生化科技有限公司；蛋白胨，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaCl固體、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉(均為分析純)、蛋白肽，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有點(diǎn)公司；特異性引物合成及基因測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

NB培養(yǎng)基：0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)牛肉膏，1%蛋白胨，0.5% NaCl固體，2%瓊脂粉，pH為7.0；脫脂乳培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物、2%脫脂乳粉、1.5%瓊脂粉；增菌液[18]：1%蛋白胨，0.5% NaCl固體，0.35%磷酸二氫鈉，0.15%磷酸二氫鉀，最終pH為7.2±0.2。

Veriti Thermal Cycler 96-well PCR儀，美國Applied Biosystems公司；BIO-RAD GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，上海安景科技有限公司；HVE-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；SG-402TX型超凈工作臺，美國THE BAKER COMPA-NY公司；Minispin Plus離心機(jī)，德國Eppendorf AG公司；HE-120核酸電泳儀，上海天能科技有限公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-25型pH計，美國奧立龍公司；XW-80A型漩渦混合儀，上海青浦滬西儀器廠；HZQ-X500C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop 2000C分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)中提到的蛋白酶基因aprX和琥珀酰輔酶A合成酶α亞基編碼基因SucD，在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載多條假單胞菌株靶點(diǎn)基因序列，利用MEGA X軟件進(jìn)行ClustalW序列對比，分析基因的保守序列，再應(yīng)用Primer premier 5.0和Oligo 7對保守序列進(jìn)行引物設(shè)計，盡量減少引物間的二聚體形成，并分析了最佳退火溫度，通過NCBI中Primer-BLAST功能對比，篩選了2對特異性較好的引物(表2)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段大小依次為232、415 bp。

表2 PCR引物信息Table 2 Information about the PCR primers

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA提取

不同的實驗中，分別采用試劑盒法或煮沸法[9]提取細(xì)菌基因組DNA。

測試菌株采用試劑盒法提取基因組DNA，使用推薦固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度活化，挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基在恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取1.5 mL菌液，按照天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，保存于-20 ℃下，作為PCR模板。原料乳及模擬樣品采用煮沸法提取基因組DNA：取8 000×g離心5 min，棄上清液，用200 mL無菌水重懸菌體，在100 ℃煮沸10 min，立即放入-20 ℃冰箱冷卻，20 000×g離心10 min，上清液即為細(xì)菌基因組DNA。

1.2.3 單重PCR反應(yīng)體系建立

單重PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate) Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL(以產(chǎn)氮假單胞菌BNCC 133928基因組DNA為模板，此類為前期從原料乳中分離嗜冷菌時出現(xiàn)較多的菌)，ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(含Gelred染料)，在100 V下電泳30 min，將目的條帶割膠回收送至上海生工測序。

1.2.4 雙重PCR反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

以標(biāo)準(zhǔn)菌株BNCC 133928產(chǎn)氮假單胞菌基因組DNA作為模板，與各種PCR反應(yīng)試劑混合，主要針對退火溫度、引物濃度配比和Taq酶量來完成雙重PCR反應(yīng)體系建立和條件優(yōu)化。

1.2.5 特異性檢測

將表1中所有菌株的基因組DNA作為模板，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，并以ddH2O作為空白對照。以此判斷此方法對常見致病菌和原料乳中常見細(xì)菌的特異性。同時陽性條帶割膠回收送至上海生工測序。

1.2.6 靈敏度檢測

使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)氮假單胞菌DNA核酸濃度，使用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取不同濃度DNA 各1 μL作為模板進(jìn)行雙重PCR，檢測雙重PCR反應(yīng)體系的靈敏度。

1.2.7 人工模擬污染原料乳檢測

將活化的產(chǎn)氮假單胞菌接種1環(huán)至NB培養(yǎng)基中30 ℃下培養(yǎng)24 h，10倍梯度稀釋，對10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋梯度進(jìn)行平板計數(shù)，平行3次。參照MARTINS等[19]的方法模擬原料乳污染實驗，將菌液用120 g/L脫脂乳梯度稀釋，得到菌液濃度為101、102、103、104、105和106CFU/mL的模擬原料乳樣品，各取1 mL 利用煮沸法。將所提DNA分別進(jìn)行雙重PCR檢測，以ddH2O作為陰性對照。模擬工業(yè)檢測中增菌處理，在225 mL增菌液中加入25 mL已滅菌的120 g/L脫脂乳，分別接入1 mL濃度為100、101、102和103CFU/mL菌液，平行3次，在30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、4、8、12和24 h各取1 mL樣品，用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行雙重PCR檢測。

1.2.8 實際原料乳樣品檢測

共15份來自北京、上海、廣州牧場的原料乳樣品，每份原料乳樣品取25 mL加入225 mL增菌液中，在30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床增菌培養(yǎng)24 h。采用煮沸法提取DNA，分別作為模板，利用雙重PCR方法進(jìn)行檢測。同時采用培養(yǎng)方法在6.5 ℃下培養(yǎng)7 d篩選可疑菌落，平行3次，以防漏檢，對篩選的菌株進(jìn)行16S rDNA 測序鑒定，并用20 g/L脫脂乳培養(yǎng)基驗證篩選的假單胞菌是否具有產(chǎn)蛋白酶能力作為對照試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR特異性檢測結(jié)果

使用單重PCR反應(yīng)驗證引物的特異性，aprX引物aprXf/aprXr的特異性驗證，結(jié)果僅在232 bp處擴(kuò)增出了預(yù)期的產(chǎn)物，sucD引物sucDf/sucDr的特異性驗證，結(jié)果僅在415 bp處擴(kuò)增出了預(yù)期的產(chǎn)物，如圖1所示。上述陽性條帶割膠回收送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI中BLAST在線對比，證實擴(kuò)增條帶為目的片段。

2.2 雙重PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化

通過對退火溫度、Taq酶量和引物濃度配比優(yōu)化后，得到最佳退火溫度為57 ℃、最佳Taq酶量為0.5 μL、最優(yōu)引物濃度配比為aprX10 μmol/L，sucD7.5 μmol/L，如圖2所示。最終雙重PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，aprXf/aprXr各1 μL(10 μmol/L)，sucDf/sucDr各1 μL(7.5 μmol/L)，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.3 雙重PCR特異性檢測結(jié)果

表1中所有菌株基因組DNA進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)1～14號陽性菌株均能擴(kuò)增出2條清晰的目的條帶；15號惡臭假單胞菌在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)擴(kuò)增出1條415 bp條帶(30 ℃下培養(yǎng)48 h不產(chǎn)蛋白酶，圖3)；其余陰性菌株均未擴(kuò)增出目的片段，如圖4所示，經(jīng)測序結(jié)果在線比對，證實確為目的片段，表明本實驗雙重PCR方法特異性良好。

2.4 靈敏度檢測結(jié)果

所提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)氮假單胞菌基因組DNA以10倍梯度稀釋至10-6，以各梯度為DNA模板進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)體系中DNA模板最終質(zhì)量濃度為1.67×10-2pg/μL時，未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，因此本方法的檢測限為1.67×10-1pg/μL。

2.5 人工模擬污染原料乳樣品的檢測結(jié)果

培養(yǎng)24 h后所得到的菌液初始濃度為3.5×108CFU/mL，將菌液用120 g/L脫脂乳分別稀釋至3.5×101、3.5×102、3.5×103、3.5×104、3.5×105和3.5×106CFU/mL，模擬被假單胞菌污染的原料乳，各取1 mL采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA后進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，結(jié)果當(dāng)菌液濃度達(dá)到3.5×106CFU/mL時，能夠清晰檢測出2條目的條帶。當(dāng)樣品經(jīng)過增菌后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)增菌12 h后，在菌液濃度為3.5×103CFU/mL 的樣品中檢測到了2條陽性條帶，當(dāng)增菌24 h后，在所有樣品中均檢測出了2條陽性條帶，如圖6。所以在適當(dāng)?shù)脑鼍幚砗?，本方法的檢測限可達(dá)到3.5 CFU/mL，檢測靈敏度高且效果良好。

2.6 實際原料乳樣品檢測

采集15份原料乳樣品，檢測結(jié)果如表3所示。經(jīng)培養(yǎng)法篩選后，測序檢測及驗證，結(jié)果僅有5份樣品檢出產(chǎn)蛋白酶假單胞菌，檢出率為30%。而通過雙重PCR方法，有10份樣品檢出2條清晰陽性條帶且無非特異性擴(kuò)增，檢出率為60%。相比之下，本研究所建立的方法更加省時且準(zhǔn)確率高。

表3 原料乳樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection results of the raw milk samples

3 結(jié)論與討論

目前我國乳制品行業(yè)的冷鏈運(yùn)輸技術(shù)沒有達(dá)到成熟階段，無法保證所有環(huán)節(jié)的冷藏溫度不產(chǎn)生較大的波動，這可能導(dǎo)致假單胞菌的大量繁殖并產(chǎn)生蛋白酶[20]。原料乳中危害性假單胞菌在運(yùn)輸貯藏等過程中所產(chǎn)生的耐熱蛋白酶等無法通過巴氏滅菌和超高溫滅菌完全清除，這是產(chǎn)蛋白酶假單胞菌對乳造成危害的主要原因之一[21]?？焖贆z測原料乳中具有危害性的假單胞菌并通過一定手段進(jìn)行控制，將有效地提高原料乳品質(zhì)。在實際工業(yè)檢測中，與傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)相比，雙重PCR方法能夠有效避免“假陽性”，并且具有省時、特異性高、靈敏性高等特點(diǎn)。

本研究結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中多種假單胞菌的sucD基因和aprX基因序列，利用軟件進(jìn)行序列分析，篩選出2對具有特異性較高且適用于雙重PCR的引物，建立了檢測效果顯著的雙重PCR方法。胡冰雪等[22]針對熒光假單胞菌gyrB基因、沙門氏菌invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因所建立的m-PCR，經(jīng)優(yōu)化后純菌DNA檢測限為1 pg/μL，增菌培養(yǎng)后熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌檢測水平分別為9、5和70 CFU/mL。本研究建立的方法對純菌DNA的檢測限為0.167 pg/μL，經(jīng)24 h增菌培養(yǎng)后檢測限可達(dá)到3.5 CFU/mL。

本方法經(jīng)過驗證具有很高的特異性和靈敏度，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)篩選的方法能夠節(jié)省大量時間、試劑等。實際檢測中無需使用試劑盒，僅通過煮沸法提取DNA即可進(jìn)行檢測，可有效的降低成本，能夠滿足工業(yè)中快速檢測的要求。此方法可應(yīng)用于乳制品行業(yè)的原料乳中產(chǎn)蛋白酶假單胞菌檢測，為奶業(yè)等控制產(chǎn)蛋白酶假單胞菌具有借鑒價值。