具有良好風(fēng)味德氏乳桿菌保加利亞亞種的篩選及其產(chǎn)香性能分析

丹彤，田佳樂，喬少婷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

酸奶是以新鮮牛奶為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品[1-2]。酸奶中含有大量的活性乳酸菌，這些乳酸菌在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括有機(jī)酸、胞外多糖、風(fēng)味化合物以及人體所必需的維生素和礦物質(zhì)等。這些菌體及其代謝產(chǎn)物具有改善酸奶風(fēng)味，提高發(fā)酵乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，調(diào)節(jié)并維持腸道菌群平衡，抑制腫瘤和免疫賦活等優(yōu)良功能[3-5]。

乳酸菌在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中可產(chǎn)生揮發(fā)性化合物，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味。近年來，一些國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者采用固相微萃取(solid phase micro-extraction，SPME)和GC-MS技術(shù)從發(fā)酵乳制品中檢測(cè)出多種風(fēng)味化合物。如2014年，PAN等[6]采用SPME-GC-MS技術(shù)分析戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)乙醇、2，3-丁二酮和乙酸等化合物對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的形成發(fā)揮重要作用；BELTN-BARRIENTOS等[7]利用此項(xiàng)技術(shù)從乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)發(fā)酵乳中鑒定了酸類、醛類、酮類、醇類等化合物。李安等[8]運(yùn)用GC-MS技術(shù)對(duì)開菲爾，西藏靈菇乳以及開菲爾粒-西藏靈菇混合發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)開菲爾粒-西藏靈菇混合發(fā)酵乳的風(fēng)味明顯優(yōu)于其他2組。

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)是生產(chǎn)酸奶及發(fā)酵乳制品的常用菌株之一，在酸奶發(fā)酵和貯藏過程中可產(chǎn)生多種風(fēng)味化合物[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS技術(shù)，以科漢森公司提供的商業(yè)發(fā)酵劑為對(duì)照組，從分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的具有良好發(fā)酵特性的德氏乳桿菌保加利亞亞種中篩選出1株具有良好風(fēng)味的菌株，并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)分析該菌株在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，為酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

實(shí)驗(yàn)用菌株及來源如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株及其來源Table 1 Experimental strains and their sources

1.2 試驗(yàn)試劑

脫脂乳粉，美國(guó)New Zealand公司；全脂乳粉，美國(guó)Fonterra公司；MRS液體培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(北京)有限公司；實(shí)驗(yàn)氣體：高純氦(純度>99.999%)。

1.3 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1214C型超凈工作臺(tái)、DHP-9272型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SRH60-70型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；7890B GC-5977A MSD型GC-MC儀、HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國(guó)Agilent公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣手柄、二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭(50/30 μm)，美國(guó)Supelco公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 制備培養(yǎng)基

于100 g/L脫脂乳粉培養(yǎng)基中添加1 g/L酵母粉，滅菌(115 ℃,7 min)，制備脫脂乳培養(yǎng)基；按11.5∶100(g∶mL)配制成全脂乳粉培養(yǎng)基，均質(zhì)(60 ℃,20 MPa)2次后，95 ℃滅菌10 min，急冷備用。

1.4.2 菌種活化

按照體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量，將實(shí)驗(yàn)菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后以同樣的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，以同樣方式連續(xù)傳代培養(yǎng)2～3次。

1.4.3 發(fā)酵

按照5×106CFU/mL接種量把上述活化的菌株接種于全脂乳培養(yǎng)基中，在42 ℃下發(fā)酵，直至發(fā)酵乳pH值降至4.5，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵乳樣品。

1.4.4 發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)方法

樣品前處理：將5 mL發(fā)酵乳樣品裝入15 mL樣品瓶中，55 ℃下平衡10 min，將老化(250 ℃，5 min)后的萃取頭插入樣品瓶中萃取50 min后插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，于250 ℃下解吸附3 min。

氣相色譜條件：起始溫度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升溫至140 ℃，保持2 min；以10 ℃/min繼續(xù)升溫至250 ℃。進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500；發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV，無溶劑延遲。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳中風(fēng)味化合物比較分析

采用SPME-GC-MS技術(shù)，以商業(yè)發(fā)酵劑為對(duì)照組，比對(duì)分析6株德氏乳桿菌保加利亞亞種在牛乳發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，結(jié)果如表2所示。酸類化合物能賦予發(fā)酵乳酸爽的口感[11-12]。Tb1-1、MGA17-6發(fā)酵乳和對(duì)照組中均檢測(cè)到乙酸，分別為6.8%、4.01%和3.68%。MGD4-2發(fā)酵乳中己酸的相對(duì)含量最高，達(dá)到9.14%，其次為Tb1-1，對(duì)照組中未檢測(cè)到己酸。乙醛是發(fā)酵乳中的重要特征風(fēng)味化合物，一定濃度的乙醛可以賦予產(chǎn)品良好的風(fēng)味，但濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生刺鼻氣味[13]。除MGB30-1、MGB45-5外，其他發(fā)酵乳和對(duì)照組中均檢測(cè)到乙醛。乙偶姻可賦予發(fā)酵乳濃郁的奶油香味[14]。MGB30-1、MGD4-2和Tb1-1發(fā)酵乳中均檢測(cè)到乙偶姻，其相對(duì)含量分別為7.08%、9.63%和17.4%。醇類化合物閾值較高，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味影響較小，但醇類化合物可使發(fā)酵乳風(fēng)味更加飽滿[15]。除MGB30-1外，其余5組德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳中均檢測(cè)到1-壬醇，其相對(duì)含量分別為1.8%、2.64%、3.91%、2.47%、0.49%和0.54%。甲酸乙烯酯可賦予發(fā)酵乳愉快的水果甜味[16]。MGB30-1、MGD4-2、MGA17-6發(fā)酵乳中均檢測(cè)到甲酸乙烯酯，其中MGB30-1發(fā)酵乳中甲酸乙烯酯含量最高，達(dá)到61.17%。

表2 發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)發(fā)酵乳中的重要揮發(fā)性風(fēng)味化合物Table 2 Some important volatile flavor compounds in the fermented milk at the end of fermentation

主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種經(jīng)典的特征抽取降維技術(shù)，通過少數(shù)幾個(gè)主分量來解釋多變量間的內(nèi)部關(guān)系，并通過圖形間重疊部分的大小與距離遠(yuǎn)近直觀反映化合物間的相似成分。本試驗(yàn)通過對(duì)6株德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳和對(duì)照組JD中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖1所示。6株德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳和對(duì)照組可聚為3個(gè)類群，其中MGD4-2與Tb1-1聚為一類，MGB29-2和MGB45-5聚為一類，MGB30-1、MGA17-6和對(duì)照組JD聚為一類。觀察發(fā)現(xiàn)，MGB30-1與對(duì)照組無重疊部分且有較小距離，MGA17-6與對(duì)照組兩者之間距離最近且有部分重疊，說明MGA17-6發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成及含量與對(duì)照組相似度最高，有較好的開發(fā)利用研究?jī)r(jià)值，因此，選擇MGA17-6作為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)一步分析該菌株從牛乳發(fā)酵到貯藏期間產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味化合物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

2.2 發(fā)酵乳中風(fēng)味化合物動(dòng)態(tài)變化

MGA17-6在牛乳發(fā)酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3、7、14 d)期間產(chǎn)生酸類、醛類、酮類、酯類、醇類、碳?xì)漕?、含氮類和雜環(huán)類等化合物，其中一些對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成有影響的揮發(fā)性化合物的種類和相對(duì)含量如表3所示。

表3 德氏乳桿菌保加利亞亞種MGA17-6發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS鑒定結(jié)果Table 3 Volatile flavor compounds in fermented milk of Lactobacillus bulgaricus MGA17-6 by SPME-GC-MS

2.2.1 酸類化合物

酸類化合物一般由脂肪分解與微生物發(fā)酵產(chǎn)生[17]。乙酸是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的重要酸類化合物之一[18]，在發(fā)酵后期(6 h)和貯藏期間其相對(duì)含量分別為3.66%、4.01%、4.68%、6.09%、4.91%和7.88%。己酸可賦予發(fā)酵乳酸味、脂肪味及乳酪味[19]，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，己酸從發(fā)酵初期至貯藏后期相對(duì)含量分別為1.07%、2.42%、3.43%、4.25%、3.49%、1.58%、0.56%，呈先上升后下降的趨勢(shì)，于貯藏1 d時(shí)達(dá)到峰值。辛酸具有微弱水果酸味[20]，在發(fā)酵和貯藏期間其相對(duì)含量分別為0.32%、1.22%、1.80%、1.80%、2.29%、1.55%和2.04%，整體呈上升趨勢(shì)。

2.2.2 醛類化合物

醛類化合物閾值較低，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的構(gòu)成具有重要作用[21]。乙醛是發(fā)酵乳中的重要風(fēng)味化合物。一般認(rèn)為，德氏乳桿菌保加利亞亞種是生產(chǎn)乙醛的主要菌株，主要是因?yàn)榈率先闂U菌保加利亞亞種不含乙醛脫氫酶，可以使乙醛不被還原而在發(fā)酵乳中累積[22]。本實(shí)驗(yàn)中乙醛相對(duì)含量較高，特別是在貯藏0 d時(shí)達(dá)到峰值(30.09%)。庚醛具有強(qiáng)烈的油脂味[23]，發(fā)酵和貯藏期間均檢測(cè)到庚醛。

2.2.3 酮類化合物

酮類化合物是由多不飽和脂肪酸經(jīng)氧化或熱降解、氨基酸降解或微生物代謝所產(chǎn)生[24]。在鑒定的酮類化合物中，2-庚酮具有輕微的藥香氣味[25]，在發(fā)酵和貯藏期間檢測(cè)到2-庚酮的相對(duì)含量分別為26.83%、14.62%、11.99%、16.90%、11.53%、14.10%和8.35%，遠(yuǎn)高于其他酮類化合物。此外，相對(duì)含量較高的酮類化合物還有2-壬酮，2-壬酮具有乳酪、奶香氣味[26]，在發(fā)酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3、7 d)期間相對(duì)含量分別為10.57%、6.34%、4.37%、7.33%、5.51%和4.59%。

2.2.4 酯類化合物

酯類化合物是發(fā)酵乳中重要揮發(fā)性化合物，具有很低的香味閾值，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成影響較大[27]。本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的酯類化合物中，相對(duì)含量較高的有甲酸乙烯酯，其在發(fā)酵(3、6 h)和貯藏(0、1、3 d)期間相對(duì)含量分別達(dá)到2.68%、5.68%、7.92%、6.23%和4.63%，整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，是發(fā)酵乳中重要的風(fēng)味化合物。

2.2.5 醇類化合物

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的醇類化合物主要有(S)-1，3-丁二醇、2-己氧基-乙醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基正乙醇等。在這些醇類化合物中，一些低分子醇在發(fā)酵和貯藏期間的相對(duì)含量較高，如1-己醇的相對(duì)含量分別為2.01%、2.56%、2.21%、2.93%、3.52%、3.22%和2.71%。

2.3 發(fā)酵和貯藏期間發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖聚類分析

利用熱圖對(duì)MGA17-6在牛乳發(fā)酵和貯藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)熱圖的垂直方向，所有樣品被分為兩大類，發(fā)酵初期(3 h)、發(fā)酵后期(6 h)及貯藏初期(0、1 d)與貯藏中后期(3、7、14 d)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類與相對(duì)含量差異明顯，發(fā)酵初期與發(fā)酵后期風(fēng)味化合物較為相似，貯藏初期、貯藏中期發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和含量相似度較高，說明牛乳在發(fā)酵和貯藏期間發(fā)酵乳的品質(zhì)發(fā)生了明顯變化。香氣成分種類繁多，物質(zhì)間相互作用，賦予發(fā)酵乳良好的品質(zhì)[10]，如醛類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)活潑，主要通過氨基酸降解產(chǎn)生，多為中間體化合物，一般不能穩(wěn)定存在，在后熟階段容易被還原成相應(yīng)的酸類化合物和醇類化合物[28]。醇類化合物的生成與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解有關(guān)[29]，分子質(zhì)量較小的酸類物質(zhì)與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物。

3 結(jié)論

(1)以科漢森公司提供的發(fā)酵劑為對(duì)照，采用SPME-GC-MS技術(shù)分析6株德氏乳桿菌保加利亞亞種在牛乳發(fā)酵終點(diǎn)(pH 4.5)時(shí)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，從中篩選出1株具有良好風(fēng)味的菌株(MGA17-6)。

(2)MGA17-6在牛乳發(fā)酵和貯藏期間產(chǎn)生的主要風(fēng)味化合物包括酸類、醛類、酮類、酯類、醇類等，其中一些重要的化合物如乙酸、乙醛、庚醛、乙偶姻、1-庚醇等對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味產(chǎn)生重要的影響。

(3)在發(fā)酵和貯藏期間，MGA17-6發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析結(jié)果表明，發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)在牛乳發(fā)酵及貯藏期間變化顯著，發(fā)酵初期(3 h)、發(fā)酵中后期(6 h)、貯藏初期(0、1 d)與貯藏中后期(3、7、14 d)差異顯著，說明發(fā)酵及貯藏期間發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類與相對(duì)含量差異明顯。