餐廚固渣酶法制備適用于污水處理的外加碳源

趙淑蘭，占潔，王濤，廖家林，趙明星，黃振興,3*

1(江南大學 環(huán)境與土木工程學院，江蘇 無錫，214122)2(無錫恒誠水利工程建設有限公司，江蘇 無錫，214000)3(江蘇省水處理技術與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州，215009)

餐廚垃圾，俗稱“泔腳”，主要是指居民日常生活、食品加工、餐飲服務、單位供餐等活動中產(chǎn)生的食物廢料和食物殘留[1]。隨著我國居民生活水平的日益提高，餐廚垃圾產(chǎn)生量也隨之增多，已經(jīng)成為我國城市生活垃圾的主要組成部分。按照生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《2019年全國大、中城市固體廢物污染環(huán)境防治年報》數(shù)據(jù)顯示，2018年度全國200個大中型城市的生活垃圾產(chǎn)生量達到21 147.3萬t，其中餐廚垃圾產(chǎn)生量約為1億t/年，到2020年預計將會突破至1.2億t[2]。

餐廚垃圾經(jīng)精細化分選和三相分離后，餐廚固渣中有機組分主要包括淀粉、蛋白質和纖維素類物質[3]。其中，淀粉類有機質是生化性非常好的有機碳源。從市政環(huán)境治理整體需求來看，我國污水處理廠普遍存在碳源缺乏問題，需要大量的外加碳源[4]。如能從餐廚固渣中回收碳源用于污水處理脫氮除磷過程，則能有效降低運行成本。然而，超聲、水熱和微波等物化方法很難實現(xiàn)碳源的有效分離[5-6]。酶催化水解技術具有反應專一、效率高、反應條件溫和等優(yōu)點，能夠定向催化特定物質的水解反應，從而實現(xiàn)目標產(chǎn)物從固相到液相的定向分離[7-8]。但是目前有關從餐廚固渣中回收碳源的研究報道較少。鑒于此，本研究采用復合淀粉酶水解法回收餐廚固渣中的有機碳源，通過單因素實驗考察酶解條件對碳源提取效果的影響，建立關鍵影響因子的響應面回歸模型并分析相互間的交互關系，明確最佳酶解條件。在此基礎上，借助等電點沉淀法進一步提高回收碳源純度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

餐廚固渣取自于江蘇省張家港市某餐廚垃圾處理廠。餐廚垃圾經(jīng)分質分選、制漿和三相分離等預處理后，餐廚固渣含水率為72.1%(質量分數(shù))，揮發(fā)性固體(volatile solid，VS)占總固體(total solid，TS)的質量分數(shù)為92.8%。粗蛋白、粗淀粉、粗纖維和粗脂肪占TS的質量分數(shù)分別為(38.7±1.7)%、(33.2±1.4)%、(16.5±0.9)%和(1.8±0.2)%。α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶購于酷爾化學科技(北京)有限公司，酶活分別為4、35、100 U/mg。3種酶的最佳作用pH值分別為6.0、5.0、5.0；最佳作用溫度分別為60、55、55 ℃。其他試驗試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淀粉酶的篩選

餐廚固渣樣品采集完成后，在105 ℃下烘干并用高速粉碎機粉碎，然后放置密封袋中于4 ℃下保藏待用。稱取20 g餐廚固渣(以TS計)分別加至血清瓶中，用去離子水調(diào)節(jié)底物質量濃度至200 g/L，在恒溫搖床中(120 r/min，60 ℃)糊化60 min后，分別加入α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。酶添加質量分數(shù)以單位質量餐廚固渣(g TS)添加酶量(g)的百分比計。恒溫搖床中(120 r/min)酶解5 h，不添加任何酶的體系為空白對照，不同酶解體系的最適反應條件如表1所示。反應結束后，將血清瓶置于100 ℃水浴鍋中熱處理15 min以滅活淀粉酶，5 000 r/min離心10 min后，提取上清液測定總糖和還原糖質量濃度以對比酶解效果。

表1 不同種類淀粉酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different kinds of amylase

1.2.2 復合淀粉酶水解的單因素試驗

在對比不同淀粉酶水解效果的基礎上，選取α-和γ-復合淀粉酶提取餐廚固渣碳源，并對水解條件進行單因素試驗。以酶添加質量分數(shù)、復合淀粉酶質量比(α/γ)、酶解溫度、酶解pH和底物質量濃度為自變量，以碳源提取率(E)為響應值，研究各因素對碳源提取效果的影響。酶解步驟參照1.2.1，反應基本條件為：底物質量濃度200 g/L、酶添加質量分數(shù)1.0%(以g/g TS計)、復合淀粉酶質量比3∶1、酶解溫度60 ℃和酶解pH 6.0。

1.2.3 響應面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素試驗結果篩選出關鍵影響因素，采用Box-Behnken響應面設計法進一步優(yōu)化組合反應條件。以底物質量濃度、酶解溫度和pH為自變量，以碳源提取率(E)為響應值進行中心組合試驗，分析自變量對響應值的主效應和交互作用。響應面優(yōu)化試驗因素與水平設計如表2所示。

1.2.4 等電點沉淀法去除蛋白質

餐廚固渣經(jīng)復合淀粉酶處理后所獲得的碳源提取液中，仍然存在一定濃度的可溶性蛋白。為了進一步提高碳源純度，借助等電點沉淀法去除碳源提取液中的蛋白質。采用0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)提取液pH值分別至3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75 、5，充分攪拌混合，在25 ℃條件下靜置1 h后，5 000 r/min離心10 min，收集上清液進行測定分析。

表2 響應面試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.3 分析測試方法

餐廚固渣的TS和VS質量分數(shù)測定采用烘干恒重法(HJ 613—2011)；粗淀粉質量分數(shù)測定采用酸水解法(GB 5009.9—2016)；蛋白質質量分數(shù)測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)；粗脂肪質量分數(shù)測定采用索氏抽提法(GB 5009.6—2016)。碳源提取液中總糖質量濃度采用苯酚-硫酸法(GB/T 15672—2009)；還原糖質量濃度測定采用3,5-二硝基水楊酸法(NY/T 2742—2015)；生化需氧量(biochemical oxygen demand,BOD)的測定采用稀釋接種法(GB/T 7488—1987)。

碳源提取率(E)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：C1，酶解后提取液中總糖的質量濃度，g/L；V1，提取液體積，L；M0，餐廚固渣中粗淀粉質量分數(shù)，%；W0，餐廚固渣的干重(以TS計)，g。

蛋白質去除率(R)的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：P0，提取液中蛋白質的質量濃度，g/L；P1，等電點沉淀后提取液中蛋白質的質量濃度，g/L。

2 結果與分析

2.1 不同種類淀粉酶對餐廚固渣碳源的提取效果

淀粉酶是能催化淀粉、糖原水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一群酶的總稱，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[9]。α-淀粉酶作用于淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物包括糊精、低聚糖和單糖；β-淀粉酶是從非還原性末端依次切開相隔的α-1,4-糖苷鍵，當作用于直鏈淀粉時，其最終產(chǎn)物主要為麥芽糖。但是β-淀粉酶不能水解和跨過支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，因此水解支鏈淀粉時其最終產(chǎn)物除了麥芽糖還會殘留下大分子的β-極限糊精。γ-淀粉酶也是一種外切酶，從淀粉分子非還原端依次切割α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，逐個切下葡萄糖殘基。無論作用于直鏈淀粉還是支鏈淀粉，γ-淀粉酶的最終產(chǎn)物均為葡萄糖。首先比較分析了3種淀粉酶對餐廚固渣中碳源的最佳水解效果。如圖1所示，餐廚固渣經(jīng)不同淀粉酶處理后，提取液中的總糖質量濃度分別為53.8 g/L(α-淀粉酶)、29.0 g/L(β-淀粉酶)和39.5 g/L(γ-淀粉酶)，而對照組僅為15.4 g/L。很顯然，α-淀粉酶最有利于餐廚固渣中淀粉的溶出，碳源提取率達到64.8%。此外，γ-淀粉酶處理后的還原糖質量濃度最高，達到21.3 g/L，約占溶解性總糖的53.9%。已有文獻表明，還原糖濃度高說明淀粉水解更為徹底，水解液則更加穩(wěn)定[10]。對比以上3種淀粉酶的水解效果，可以看出α-淀粉酶和γ-淀粉酶的碳源提取率均優(yōu)于β-淀粉酶，而γ-淀粉酶處理后的還原糖濃度要高于α-淀粉酶。因此進一步選取α-淀粉酶和γ-淀粉酶協(xié)同處理餐廚固渣以提高碳源提取效果，并對其復合酶解條件進行單因素試驗。

2.2 復合淀粉酶水解餐廚固渣的單因素實驗

2.2.1 酶添加質量分數(shù)與α/γ添加質量比對碳源提取效果的影響

如圖2-a所示，通過添加復合淀粉酶能夠有效促進餐廚固渣的碳源提取。當復合酶添加質量分數(shù)分別為0.6%、0.8%和1.0%時，碳源提取率分別達到了72.1%、75.3%和75.9%，均明顯優(yōu)于單一淀粉酶的作用效果。進一步考察了復合酶質量比(α/γ)對餐廚固渣碳源水解的影響。結果顯示，碳源提取率隨著α/γ添加質量比的增加呈先升后降的趨勢；當復合酶質量比為3∶1時，碳源提取率達到最高值(圖2-b)。由此可見，復合淀粉酶的協(xié)同作用可以更為有效地回收餐廚固渣中的碳源。這是因為當α-淀粉酶與γ-淀粉酶共同作用時，α-淀粉酶可將淀粉水解成糊精和低聚糖等產(chǎn)物，從而為γ-淀粉酶提供了更多的非還原性末端；而γ-淀粉酶能夠將糊精和低聚糖進一步水解，理論上有助于α-淀粉酶的催化反應[11]。此外，在一定范圍內(nèi)，酶添加質量分數(shù)(0.6%、0.8%、1.0%)和添加質量比(2∶1、3∶1、4∶1)對復合酶的作用效果影響并不顯著(P>0.05)。從成本等方面綜合考慮，最佳酶添加質量分數(shù)和復合酶質量比分別確定為0.6%和3∶1。由此可見，相較于單一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶協(xié)同處理不僅可以提高碳源提取效果，而且酶使用量更少。

2.2.2 酶解溫度對復合酶作用效果的影響

溫度是影響酶催化活性的關鍵因素之一[12]。針對2種淀粉酶反應條件的差異，進一步分析了酶解溫度對復合淀粉酶作用效果的影響。如圖3所示，餐廚固渣碳源提取率隨著酶解溫度的上升呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當反應溫度從40 ℃升高至60 ℃，碳源提取率從65.0%逐步增加至73.9%；但是進一步提高反應溫度會破壞酶的空間結構，導致酶活性降低，碳源提取率顯著下降至50.4%(80 ℃)。實驗結果表明，溫度對碳源提取率的影響極顯著(P<0.01)，因此進一步選擇50、60、70 ℃ 3個水平進行響應面分析。

2.2.3 pH值對復合酶作用效果的影響

在酶促反應過程中，pH變化不僅影響底物的解離狀態(tài)，而且會改變酶分子活性位點的必需基團解離形態(tài)和空間構象，進而影響酶活性[13]，且不同的酶對pH變化的響應各不相同。因此本研究考察了不同pH條件下復合淀粉酶的協(xié)同作用效果。如圖4所示，當pH值為3～6時，餐廚固渣碳源提取率從44.0%顯著提高至73.2%；繼續(xù)提高pH會導致酶解效果下降，碳源提取率在pH 8.0的條件下顯著降低至52.6%。實驗結果分析表明復合淀粉酶的作用效能受pH影響較為顯著(P<0.01)，因此進一步選擇pH 5.0、6.0和7.0三個水平進行響應面分析。

2.2.4 底物質量濃度對復合酶作用效果的影響

底物質量濃度對復合淀粉酶作用效果的影響如圖5所示。餐廚固渣碳源提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當?shù)孜镔|量濃度為200 g/L時，復合酶解效果最好，餐廚固渣碳源提取率達到73.6%。適當?shù)牡孜餄舛饶軌蛟诒ＷC酶分子與反應底物充分接觸的同時，促進更多的底物轉化，因此有助于提高酶催化效率[14]。但是過高的底物濃度會造成有效濃度下降，反應體系黏度的增大會抑制各組分的擴散，酶分子和底物無法充分結合，導致酶解效率降低。此外，高濃度底物還可能與酶分子形成無活性的中間復合物，從而抑制酶促反應[15]。實驗結果分析表明，底物質量濃度對餐廚固渣碳源提取效果影響極顯著(P<0.01)，因此進一步選擇底物質量濃度150、200、250 g/L 3個水平進行響應面分析。

2.3 Box-Behnken響應面優(yōu)化結果

2.3.1 模型的建立與顯著性分析

單因素實驗結果表明，酶解pH(A)、底物質量濃度(B)和溫度(C)對復合淀粉酶作用效果的影響極為顯著(P<0.01)。因此，本研究以此3個因素為自變量，以碳源提取率為響應值(E)，進一步采用Box-Behnken響應面法對餐廚固渣碳源提取工藝條件展開優(yōu)化。響應面分析結果如表3所示，1～12號是析因實驗，13～17號是中心實驗。17個實驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量，零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復5次。通過數(shù)據(jù)擬合建立二次回歸模型：

E=74.66+1.82A-3.55B-1.93C+0.9AB-0.78AC+1.72BC-6.28A2-12.58B2-3.81C2。

表3 優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and result of response surface experiment

表4 回歸模型方差分析Table 4 The variance analysis of regression model

2.3.2 最佳酶解條件的預測及實驗驗證

通過對二次多項數(shù)學模型進行解析，3個顯著性影響因素的最佳條件為：酶解溫度56.96 ℃、pH 6.15、底物質量濃度192.2 g/L，理論碳源提取率預測值為75.4%。進一步通過實驗對模擬結果進行驗證，實驗條件設置為：酶解溫度57.0 ℃、pH 6.2、底物質量濃度190 g/L，酶添加質量分數(shù)0.6%以及復合酶質量比3∶1。通過4次驗證實驗，最終獲得的餐廚固渣碳源提取率為(76.9±3.1)%，與理論預測值誤差僅為1.5%，確認了該模型的有效性。

2.4 等電點沉淀法提高碳源純度

餐廚固渣復合酶解提取碳源過程中會有一些蛋白質隨之溶出，影響碳源純度。等電點沉淀法是利用蛋白質在等電點時溶解度最低的特性，通過調(diào)節(jié)液相pH使蛋白質沉淀析出的方法[17]。施正華等[18]通過等電點沉淀法回收污泥水解液中的蛋白質，蛋白質回收率可達到87.5%，展現(xiàn)出較好的沉淀效果。因此本研究進一步考察了等電點沉淀法對餐廚固渣復合淀粉酶水解液中蛋白質的去除效果。初始水解液中蛋白質質量濃度為13.6 g/L。通過動態(tài)調(diào)節(jié)pH可以發(fā)現(xiàn)蛋白質濃度在pH 3.0～5.0呈現(xiàn)出U型曲線(圖6)。當pH值為3.75時，水解液中蛋白質質量濃度下降至9.4 g/L，蛋白質去除率達到30.9%。結果表明，借助蛋白質等電點沉淀法可以進一步提高水解液中的碳源純度。

表5 等電點處理前后提取液有機質濃度變化Table 5 Changes of organic matter concentration in the extracting solution by isoelectric precipitation

3 結論

采用淀粉酶水解結合等電點沉淀法可以較好地回收餐廚固渣中的有機碳源。研究結果證明，相較于單一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶的協(xié)同作用能夠在較少的酶使用量下顯著提高碳源提取效率。通過單因素實驗和響應面優(yōu)化得到最佳酶解條件：酶解溫度57.0 ℃、pH 6.2、底物質量濃度190 g/L，酶添加質量分數(shù)0.6%以及復合酶質量比3∶1，碳源提取率達到76.9%。等電點沉淀法能夠進一步提高回收碳源純度，回收液中BOD質量濃度和BOD/N分別達到了76.8 g/L和51.2，完全有潛力作為污水處理的外加碳源使用。研究結果可為我國餐廚垃圾的精細化、資源化利用提供有益思路。