柑橘中高風險農(nóng)藥及主要代謝物的消解轉(zhuǎn)化特征及健康風險評價

李志霞，董超，周杰，安文進，張耀海，李晶，王成秋，梁國魯，焦必寧*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(西南大學 園藝園林學院，重慶，400715)

隨著人們健康意識不斷增強，“吃得營養(yǎng)、吃得健康”成為現(xiàn)代人飲食的主流觀念，日常膳食消費已由溫飽型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型，水果攝入量不斷增加。柑橘含有多種生理活性物質(zhì)，具有重要的保健功能[1-2]，在居民膳食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著越來越重要的地位。2018年，我國柑橘產(chǎn)量達到4 138.1×104t，占水果總產(chǎn)量的16.1%，成為我國第一大水果[3]。然而，作為直接鮮食的初級農(nóng)產(chǎn)品，柑橘使用農(nóng)藥后其消解變化動態(tài)及果實中殘留的農(nóng)藥攝入人體后是否對人體健康產(chǎn)生危害，風險水平如何等質(zhì)量安全問題受到廣大消費者的持續(xù)關(guān)注，也成為該領(lǐng)域近年來的研究熱點之一[4-6]。

柑橘生長周期長，病蟲害多發(fā)，生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥種類較多。張耀海等[7]對我國6省(市)主產(chǎn)地的198個柑橘樣品中的農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀進行分析評價，發(fā)現(xiàn)48.9%的樣品中有農(nóng)藥殘留，質(zhì)量安全存在潛在風險。近來，LI等[8]進一步研究分析了我國2 922份柑橘果實樣品的農(nóng)藥殘留狀況，發(fā)現(xiàn)有86%的樣品中存在40種不同的農(nóng)藥殘留，其中，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱殘留均為影響柑橘質(zhì)量安全的重要危害因子。這3種農(nóng)藥均為廣譜類殺蟲劑，在我國柑橘生產(chǎn)中應(yīng)用極為廣泛。此外，已有研究表明，毒死蜱在環(huán)境和動植物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP)比毒死蜱毒性更強，而且有可能與毒死蜱存在協(xié)同效應(yīng)[9-10]。目前，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱和TCP的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11-16]，但尚未見關(guān)于其同時檢測的方法以及在柑橘中的消解轉(zhuǎn)化和健康風險評價方面的相關(guān)研究報道。為此，本試驗以常見柑橘品種溫州蜜柑為對象，建立4種農(nóng)藥化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測技術(shù)，同時采用田間噴藥和動態(tài)取樣的方式研究丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱及其代謝物在溫州蜜柑中的消解與代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，并對其可能存在的急性和慢性膳食暴露風險進行初步評價，以期為我國柑橘質(zhì)量安全生產(chǎn)、監(jiān)測和消費引導提供重要的技術(shù)支撐和切實參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

丙溴磷標準品(純度≥99%)、聯(lián)苯菊酯標準品(純度≥99.5%)、毒死蜱標準品(純度≥99%)、TCP標準品(純度≥98%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；乙酸銨(色譜純)，德國Honeywell-Fluka公司；乙二胺基-N-丙基(primary secondary amine，PSA)，上海安譜科學儀器有限公司；石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)，上海安譜科學儀器有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)，江蘇強盛化工有限公司。試驗用丙溴磷(50%乳油，青島中達農(nóng)業(yè)科技有限公司)、聯(lián)苯菊酯(25 g/L乳油，南寧泰達豐生物科技有限公司)、毒死蜱(40%乳油，浙江新農(nóng)化工股份有限公司)，購于當?shù)剞r(nóng)資商店。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；QTRAPTM 6500三重四極桿線性離子阱復合質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超純水系統(tǒng)Milli-Q AdvantageA10，美國Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機，美國Thermo Fisher公司；CK 2000型高通量組織研磨儀，北京Thmorgan生物科技有限公司。

1.3 田間試驗與樣品采集

供試柑橘品種為溫州蜜柑，于2019年8～10月在重慶市歇馬鎮(zhèn)柑桔研究所柑橘試驗園內(nèi)(海拔222.8 m，緯度29°76′63 N，經(jīng)度106°39′16 E)進行。采用噴霧法對柑橘樹進行農(nóng)藥噴施，其中，消解轉(zhuǎn)化動態(tài)試驗以所選農(nóng)藥最高推薦劑量的1.5倍液(丙溴磷375 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯47 mg a.i./kg、毒死蜱750 mg a.i./kg，a.i.表示有效成分)為施藥劑量噴藥1次，并分別于噴藥后0(2 h)、1、3、7、14、21、28、35、45和60 d按隨機法進行果實樣品采集；最終殘留量試驗按良好農(nóng)業(yè)規(guī)范，以所選農(nóng)藥的最高推薦劑量(丙溴磷250 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯31 mg a.i./kg、毒死蜱500 mg a.i./kg)進行噴施，丙溴磷2次、毒死蜱2次、聯(lián)苯菊酯1次，并分別于各自的安全間隔期(pre-harvest interval，PHI)、安全間隔期前1周、安全間隔期后1周各采樣1次。丙溴磷和毒死蜱的PHI為28 d，聯(lián)苯菊酯為21 d。以4株柑橘樹為1個試驗小區(qū)，每個處理重復3次，以清水噴施為對照。每個處理采樣不少于2 kg，樣品采集標號后，置于加冰保溫盒中運至實驗室。用勻漿機對樣品進行勻漿，于-20 ℃冷凍保存，待測。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

采用本實驗室優(yōu)化驗證的QuEChERS方法：稱取柑橘果實樣品5.00 g于25 mL離心管中，加入10.00 mL乙腈，垂直振蕩提取10 min，加入2.00 g無水硫酸鎂和0.50 g氯化鈉，垂直振蕩1 min后，10 000 r/min離心5 min。移取1.50 mL上清液加入裝有25 mg GCB的4 mL離心管中，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，上機檢測。

1.4.2 標準工作液的配制

分別準確稱取約10.0 mg農(nóng)藥標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。取相應(yīng)量的單標儲備液于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成10 mg/L的標準混合儲備液，于-20 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。使用時，為消除基質(zhì)效應(yīng)，將標準混合儲備液按照1.4.1方法處理后的柑橘提取液溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的系列標準溶液，于4 ℃條件下保存。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 2 C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：2.0 μL；流速：0.4 mL/min；流動相A：5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min，10% B；5～8 min，90% B；8～10 min，10% B。

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱為正離子掃描，TCP為負離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度：450 ℃；電壓5 500 V(ESI +)/-4 500 V(ESI-)；霧化氣壓力：344.7 kPa；氣簾氣壓力：241.3 kPa。MRM 質(zhì)譜參數(shù)見表 1。

表1 所選農(nóng)藥的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters for the selected pesticides

1.4.5 方法學考察

取柑橘空白樣品，添加3個或以上濃度水平的混合標準溶液進行加標回收率和精密度試驗，每個濃度做5次平行，以滿足農(nóng)藥殘留分析回收率要求的最低添加濃度為方法定量限(limit of quantity，LOQ)。

1.5 膳食暴露風險評估

農(nóng)藥殘留膳食暴露風險評估即對經(jīng)膳食途徑攝入人體內(nèi)的農(nóng)藥殘留量進行定量評價，通常使用食物消費數(shù)據(jù)和化學物濃度檢測數(shù)據(jù)，結(jié)合人體體重數(shù)據(jù)，獲得膳食暴露量的估計，再與國際公認的毒性參考劑量進行比較，評估目標化合物對人體健康的潛在風險。慢性膳食暴露風險按公式(1)、公式(2)進行計算[16]，急性膳食暴露風險按公式(3)、公式(4)進行計算[17]，暴露風險值HQ<1時，健康風險在可接受范圍內(nèi)；而HQ>1時，存在不可接受的健康風險。

(1)

(2)

式中：HQChronic為慢性膳食暴露風險；EDI為每日估計攝入量(mg/kg bw)；ADI為每日允許攝入量(mg/kgbw)，源自WHO數(shù)據(jù)庫[18]；DC為農(nóng)藥殘留檢出濃度(mg/kg)；FC為柑橘的人均消費量(kg)；BW為人群平均體重(kg bw)。不同人群體重與柑橘消費數(shù)據(jù)來源于WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)[19]。

(3)

(4)

式中：HQAcute為急性膳食暴露風險；ESTI為短期估計攝入量(mg/kg bw)；ARfD為急性參考劑量(mg/kg)，源自WHO數(shù)據(jù)庫[18]；LP為柑橘日消費大份餐(kg)；HR為柑橘中檢出的最高農(nóng)藥殘留濃度(mg/kg bw)；v為變異因子；BW為人群平均體重(kg bw)。柑橘日消費大份餐和變異因子數(shù)據(jù)來源于WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證結(jié)果

用柑橘果實空白樣品提取液逐級稀釋標準溶液配制基質(zhì)匹配標準溶液，以農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標作標準曲線，以基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。做4個濃度水平的添加回收實驗，添加水平為2～1 000 μg/kg，每個添加濃度重復5次，其定量限、相關(guān)系數(shù)、添加回收率等結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所選農(nóng)藥的線性良好(r2>0.99)，LOQs在2～10 μg/kg。在4個加標水平下，所選農(nóng)藥的回收率為80%～108%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.43%～9.76%，該方法具有良好的準確度和精密度，可滿足所選農(nóng)藥殘留檢測分析要求[20]。所選農(nóng)藥的UPLC-MS/MS色譜圖見圖1。

表2 試驗農(nóng)藥的LOQ、相關(guān)系數(shù)(r2)、回收率和RSDsTable 2 The LOQs, correlation coefficient (r2), recoveries and RSDs for the experimental pesticides

2.2 柑橘生長發(fā)育過程中試驗農(nóng)藥的殘留消解變化

監(jiān)測了丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱及其代謝物TCP在柑橘生長發(fā)育過程中的殘留消解動態(tài)變化，如圖2所示。施藥后2 h，測得的丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱和TCP原始殘留量分別為402.87、91.54、593.27和3.23 μg/kg。施藥14 d內(nèi)，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱的殘留量快速消解，14 d時消解率分別達到62.8%、66.0%和89.4%，均降至各自的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)值以下[21]，但與其他農(nóng)藥相比，3種農(nóng)藥在柑橘中的消解速度慢，較難降解[22-24]。之后，三者殘留量呈穩(wěn)定消解趨勢，施藥60 d時消解率為80.7%～95.5%。TCP殘留量呈先升后降趨勢，施藥14 d時達到原始殘留濃度的3.62倍，可能是毒死蜱進行代謝轉(zhuǎn)化增加了TCP的殘留量；14 d后TCP的殘留量快速消解，表明TCP在柑橘體內(nèi)積累至一定濃度后開始降解代謝[25]，到60 d時殘留濃度為3.69 μg/kg，與施藥14 d時的最高濃度相比，消解率為68.4%?？梢姡琓CP在柑橘中的消解速度比毒死蜱更低。

2.3 柑橘中試驗農(nóng)藥殘留的健康風險評價

膳食暴露風險評估是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評估的重

要組成部分，也是衡量產(chǎn)品安全性的手段之一。柑橘果實是典型的非呼吸躍變型水果，其果皮和果肉的成熟度往往不同步。溫州蜜柑是寬皮柑橘的主要品種，在我國果實一般9月中下旬成熟，在完熟期之前，溫州蜜柑果實在綠熟期和轉(zhuǎn)色期就可能被采摘食用[26-27]，使用高風險農(nóng)藥是否會對消費者產(chǎn)生健康風險需進行評價。本研究分析了3種常用殺蟲劑在溫州蜜柑中按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范施用后，安全間隔期及其前后各1周采樣對我國消費者的膳食風險水平。由表3和表4可知，慢性和急性暴露風險值隨安全間隔期延長而降低，慢性暴露風險表現(xiàn)為毒死蜱>丙溴磷>聯(lián)苯菊酯，分布范圍在0.000 8～0.002 3，急性暴露風險表現(xiàn)為聯(lián)苯菊酯>毒死蜱>丙溴磷，分布范圍在0.000 1～0.004 5，均遠低于安全界限1。因此，按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范在溫州蜜柑上施用丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱農(nóng)藥后，在安全間隔期前1周至后1周期間內(nèi)，溫州蜜柑中丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱的殘留濃度對人體健康的急性或慢性膳食暴露風險均在可接受范圍內(nèi)，與前人研究的水果中農(nóng)藥殘留相關(guān)風險評估結(jié)果基本一致[4,17,24,28]。

表3 試驗農(nóng)藥對我國消費者的慢性膳食風險評估Table 3 The chronic dietary risk assessment of the selected pesticides for Chinese consumers

表4 試驗農(nóng)藥對我國消費者的急性膳食風險評估Table 4 The acute dietary risk assessment of the selected pesticides for Chinese consumers

3 結(jié)論

柑橘樣品經(jīng)QuEChERS方法處理后，采用UPLC-MS/MS技術(shù)進行檢測，結(jié)果表明該方法操作簡單，具有良好的準確度和精密度，可滿足試驗農(nóng)藥殘留檢測分析要求。在柑橘生長發(fā)育過程中，丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱呈先快速消解后緩慢穩(wěn)定消解的趨勢，而TCP殘留量先升高后下降，消解速度較慢，安全間隔期及其前后1周的殘留濃度均在各自的MRL值以下。按照良好農(nóng)業(yè)規(guī)范在溫州蜜柑上施用丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱后，溫州蜜柑中丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱的殘留濃度對人體健康的急性或慢性膳食暴露風險均在可接受范圍內(nèi)。