不同培養(yǎng)條件對(duì)枯草芽胞桿菌BS168-ΔsinR生物膜形成及維生素K2產(chǎn)量的影響

吳靜，李偉，馮靜靜，周夢(mèng)潔，胡汶松，汪劍，SOKHNA MBACKE Gningue，吳佳雯，趙禮軍，徐文瀚，薛正蓮,2，王洲,2，劉艷,2*

1(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)2(安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖，241000)

維生素K2是枯草芽胞桿菌及納豆芽胞桿菌能量代謝電子傳遞系統(tǒng)的重要組成元素，在電子傳遞、氧化磷酸化、主動(dòng)運(yùn)輸、內(nèi)生孢子形成以及體內(nèi)ATP的生成和維持生命活動(dòng)等方面，都起著舉足輕重的作用[1-3]?？莶菅堪麠U菌及納豆芽胞桿菌合成食品級(jí)維生素K2，近幾年主要有CUI等[4-5]、MAHDINIA等[6]和BERENJIAN等[7]在研究，研究的內(nèi)容大多集中于發(fā)酵過程的代謝調(diào)控。其中BERENJIAN等[8]通過多年的研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽胞桿菌搖瓶規(guī)模下靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生了大量生物膜，而這些生物膜的形成明顯促進(jìn)了維生素K2的合成。隨后，美國賓夕法尼亞州立大學(xué)MAHDINIA等[9]為促使納豆芽胞桿菌維生素K2的大規(guī)模合成，專門研制了可以增強(qiáng)生物膜形成的生物反應(yīng)器，通過優(yōu)化發(fā)酵過程參數(shù)發(fā)現(xiàn)，形成生物膜后納豆芽胞桿菌維生素K2的合成量比游離狀態(tài)時(shí)的合成量增加了58%[10]。然而，當(dāng)在野生型芽胞桿菌培養(yǎng)基中添加維生素K2抑制劑二苯胺時(shí)，培養(yǎng)基中沒有生物膜形成。外源添加維生素K2后，生物膜結(jié)構(gòu)又重新出現(xiàn)[11]。并且，在其他革蘭氏陽性菌中，同樣發(fā)現(xiàn)維生素K2是形成復(fù)雜菌落形態(tài)和生物膜的重要元素[12]。因此，枯草芽胞桿菌生物膜的形成，對(duì)于促進(jìn)維生素K2的合成代謝，具有十分重要的意義；并且，維生素K2對(duì)于枯草芽胞桿菌生物膜的形成，同樣舉足輕重。

研究表明sinR參與BS168生物膜的形成，但具體哪些因素影響sinR基因?qū)ι锬さ恼{(diào)控機(jī)制尚未見完整報(bào)道，并且該基因表達(dá)量的不同對(duì)維生素K2的合成是否有影響尚未可知。因此，本論文以微生物生長(zhǎng)外部調(diào)節(jié)因素為介質(zhì)，通過研究pH值、溫度、金屬離子對(duì)BS168、BS168-ΔsinR菌株生物膜形成和維生素K2合成能力的影響，為分析SinR蛋白在調(diào)控生物膜過程受哪些外界因素干擾，并為進(jìn)一步研究革蘭氏陽性菌生物膜的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽胞桿菌BS168、大腸桿菌JM109、P7C6、PDG-CRE質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：大豆蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、甘油、胰蛋白胨、瓊脂條、NaCl、酵母提取物、葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

其他相關(guān)試劑：PRIME STAR、膠回收純化試劑盒，Takara；50×TAE緩沖液、氨芐霉素、氯霉素，上海生工生物；細(xì)菌基因組試劑盒，天根生物；苯酚、H2SO4、結(jié)晶紫、無水乙醇、MnCl2、FeSO4、CaCl2，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

儀器：PCR儀，美國伯樂；SK-1快速混勻器，上海醫(yī)用激光儀器廠；雙層振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱，知楚儀器；酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；水浴鍋、pH計(jì)，梅特勒；核酸定量?jī)x、HPLC，島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

Sipizizen感受態(tài)培養(yǎng)基：SPI溶液、SPII溶液、50 mmol/L CaCl2、250 mmol/L MgCl2。

平板活化培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂條20，調(diào)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

生物膜與發(fā)酵SYG培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨50、酵母提取物20、甘油50、K2HPO43.86、KH2PO41.62、微量元素2 mL(過濾除菌后加入滅菌后的培養(yǎng)基中)。將配制好的培養(yǎng)基分裝并調(diào)節(jié)pH為5、6、7、8、9，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 構(gòu)建BS168-ΔsinR菌株

根據(jù)枯草芽胞桿菌基因組圖譜用Snapgene設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別是左同源臂上下游引物、中間部分(目的基因)上下游引、右同源臂上下游引物(約1 000 bp)。引物合成委托金唯智生物技術(shù)有限公司來完成(見表1)。利用三重融合PCR將3個(gè)片段進(jìn)行連接。將純化后的PCR產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再通過使用cre/lox系統(tǒng)去除宿主細(xì)胞的抗性標(biāo)記，最終得到陽性克隆菌株。將菌株用甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 枯草芽胞桿菌的活化及培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出菌種在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到單菌落。將單菌落挑入到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入搖床37 ℃、220 r/min，培養(yǎng)12～16 h，按5%的接種比例將種子培養(yǎng)液加入每孔含2 mL的SYG培養(yǎng)基的24孔板中，放入恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定72 h形成的生物膜，每組樣品做3組平行。

表1 用于基因敲除和過表達(dá)的擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for gene knockout and overexpression

1.2.4 生物膜的形成與測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[13]，以24孔板為載體，每孔中加入5%的菌液，然后加入2 mL的SYG培養(yǎng)基，3個(gè)重復(fù)孔，并且以空SYG培養(yǎng)基作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)72 h定量測(cè)定生物膜。首先緩慢移除每孔中的培養(yǎng)物，然后用無菌的PBS緩沖液清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，室溫干燥后加入2 mL的0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色20 min，再用PBS進(jìn)行緩慢沖洗，直至流出無色為止，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入2 mL 的95%乙醇進(jìn)行脫色15 min, 然后混勻。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm的值衡量生物膜的多少。

1.2.5 培養(yǎng)條件對(duì)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響：菌株按1.2.3培養(yǎng)并置于20、25、30、37、40、45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。按1.2.4，檢測(cè)不同溫度所形成的生物膜的OD570nm值。

不同pH值對(duì)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的影響：按1.2.4生物膜形成測(cè)定方法，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)生物膜培養(yǎng)基的pH值。測(cè)定pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時(shí)形成生物膜的OD570nm值。

Mn2+、Fe2+和Ca2+對(duì)生物膜形成的影響：生物膜培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的Mn2+、Fe2+和Ca2+，使其中Mn2+濃度分別為0、0.01、0.1、1、10和100 mmol/L；Fe2+濃度分別為0、1、10、50和100 μmol/L；Ca2+濃度分別為0、0.01、0.1、1、10 mmol/L。分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h，每個(gè)樣品做3次平行，按1.2.4，檢測(cè)不同濃度金屬離子所形成生物膜的OD570nm值。

1.2.6 胞外蛋白的檢測(cè)

菌株按1.2.3培養(yǎng)，分別測(cè)定BS168與BS168-ΔsinR在上述實(shí)驗(yàn)中不同溫度、pH以及不同濃度的金屬離子(Mn2+、Fe2+、Ca2+)靜置培養(yǎng)72 h生物膜的胞外蛋白的含量。利用核酸定量?jī)x進(jìn)行蛋白測(cè)量。

1.2.7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法

配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L)，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、100、200、300、400、600、800、1 000 μL，置具塞試管中，每管分別加6%的苯酚溶液500 μL混勻，然后加入3 mL的硫酸溶液，再混勻，置沸水浴20 min，用冰水浴冷卻后于490 nm處測(cè)定各溶液的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=1.503 8x-0.027 4，相關(guān)性系數(shù)R2=0.993，表明葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.8 胞外多糖的檢測(cè)

菌株按1.2.3培養(yǎng)，將孔板中的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中離心去上清液稱重，加入約3倍質(zhì)量的無水乙醇混勻，放入4 ℃冰箱過夜，離心棄上清液，再加入原質(zhì)量的純化水混勻，按上述方法測(cè)OD490nm的值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算糖的質(zhì)量濃度[14]。

1.2.9 維生素K2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

稱取恒重的維生素K2的標(biāo)準(zhǔn)品，用10 mL的流動(dòng)相[V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶9]將標(biāo)品定溶于10 mL棕色容量瓶中，制成母液。再用流動(dòng)相將母液稀釋成不同濃度梯度的維生素K2溶液，用高效液相色譜儀檢測(cè)峰面積。以248 nm處做維生素K2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和產(chǎn)量測(cè)定。得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y= 14 368x+1 272.3，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6，表明維生素K2濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

1.2.10 發(fā)酵液中維生素K2產(chǎn)量的測(cè)定

由于維生素K2是枯草芽胞桿菌發(fā)酵的后期產(chǎn)物，在這里我們對(duì)2株菌進(jìn)行了7 d的發(fā)酵。按照參考文獻(xiàn)[15]，將不同溫度、pH和金屬離子濃度的菌液置于相應(yīng)的培養(yǎng)條件中，用100 mL三角瓶靜置培養(yǎng)7 d后，將其混勻取2 mL發(fā)酵液到離心管中，加入其4倍體積的異丙醇與正己烷混合液(1∶2，體積比)，用漩渦混勻振蕩器混勻。避光靜置30 min后，離心取上層萃取液于5 mL離心管中，用0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，得到樣品，用HPLC進(jìn)行測(cè)量。將測(cè)量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算維生素K2的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用SPSS、Origin軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1BS168-ΔsinR菌株的構(gòu)建

按照1.1.2中設(shè)計(jì)的引物和實(shí)驗(yàn)步驟，擴(kuò)增sinR基因的3個(gè)片段，再通過融合PCR的方法得到目的基因，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的基因擴(kuò)增成功(圖1)。采用spizizen轉(zhuǎn)化法將融合PCR得到的目的基因轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌中(圖2)。再將得到的陽性克隆用抗性平板驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后去除抗性。將得到的菌株經(jīng)過測(cè)序，用軟件snapgene比對(duì)，顯示sinR基因敲除成功。

M-5 000堿基DNA對(duì)照；泳道 1、2-sinR上游；泳道3、4-中間片段；泳道5、6：sinR下游圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Agarose gel electrophoresis for testing PCR amplification of the target gene

M-5 000堿基DNA對(duì)照；泳道 1、2、3、4-敲除sinR圖2 菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖譜驗(yàn)證Fig.2 Agarose gel electrophoresis of colony PCR

2.2 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度對(duì)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的外部形態(tài)及形成量的影響

由圖3可知，重組菌BS168-ΔsinR在不同的培養(yǎng)條件下，生物膜的生長(zhǎng)狀態(tài)均優(yōu)于原始菌BS168。

由圖4-a可知，BS168-ΔsinR與BS168生物膜的形成量在37 ℃時(shí)無顯著性差異，在其他溫度條件下，BS168-ΔsinR生物膜形成量均要高于BS168(P<0.05)。在37和40 ℃BS168成膜能力強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值大，在20和45 ℃BS168幾乎不產(chǎn)生物膜。而BS168-ΔsinR僅在20 ℃時(shí)成膜能力弱，在其他溫度條件下均能形成生物膜，在40 ℃時(shí)菌株成膜能力最強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值最高。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，低溫會(huì)抑制生物膜的形成[16-17]，主要由于菌在低溫條件下生長(zhǎng)和代謝速率的降低有關(guān)。相比原始菌BS168，重組菌BS168-ΔsinR的成膜能力更強(qiáng)，尤其在高溫條件下形成生物膜的能力更突出。

圖3 培養(yǎng)72 h不同生長(zhǎng)條件下的生物膜Fig.3 The morphologies of biofilm under different cultivated conditions of 72 h

圖4-b顯示，當(dāng)pH=8時(shí)，BS168與BS168-ΔsinR菌株形成生物膜的OD570nm值最大，且重組菌生物膜的形成量顯著高于出原始菌(P<0.05)。當(dāng)pH=5、9時(shí)BS168幾乎不產(chǎn)生物膜。而BS168-ΔsinR僅在pH值為5時(shí)，生物膜成膜能力弱，在其他pH條件下均能較好的形成生物膜。相比與BS168重組菌BS168-ΔsinR在弱酸和弱堿條件下形成生物膜的能力更強(qiáng)。

圖4-c顯示，重組菌BS168-ΔsinR與原始菌BS168生物膜的形成量在Mn2+為100 mmol/L時(shí)無顯著性差異，在其他濃度條件下，重組菌生物膜形成量均高于原始菌(P<0.05)，低濃度的Mn2+均能促進(jìn)BS168與BS168-ΔsinR生物膜的形成。在Mn2+為0.01 mmol/L時(shí)BS168形成生物膜的OD570nm最高，在其他濃度條件下，BS168幾乎不能形成生物膜。而BS168-ΔsinR僅在Mn2+為100 mmol/L時(shí)，生物膜的形成受到影響，在其他濃度下均能較好的形成生物膜。對(duì)于Mn2+對(duì)生物膜的作用機(jī)制尚不清楚，但已知它參與了細(xì)胞外主要聚合物質(zhì)的產(chǎn)生[18]，從而通過支持微生物細(xì)胞聚集在一起，來幫助生物膜的形成。

圖4-d顯示，重組菌BS168和原始菌BS168-ΔsinR添加不同濃度的Fe2+均能形成生物膜，重組菌生物膜的形成量要顯著高于原始菌(P<0.05)。在Fe2+為1 μmol/L 時(shí)，2株菌成膜能力強(qiáng)，表現(xiàn)出OD570nm值大。但不同濃度的Fe2+對(duì)BS168-ΔsinR生物膜的形態(tài)有比較明顯的影響，在Fe2+為1、10 μmol/L時(shí)，生物膜較光滑，F(xiàn)e2+為50、100 μmol/L時(shí)生物膜形成的褶皺較多。鐵是許多需氧微生物的必需元素，在電子轉(zhuǎn)移和許多其他酶反應(yīng)中是主要成分。其在生物膜的形成中發(fā)揮著重要的作用[19]，細(xì)胞內(nèi)的鐵是生物膜發(fā)育的信號(hào)分子[20]，適當(dāng)濃度的鐵會(huì)促進(jìn)生物膜的形成。

圖4 不同生長(zhǎng)條件對(duì)生物膜形成的影響Fig.4 Effects of different cultivated conditions on biofilm formation注：圖中字母相同表示無顯著性差異(P<0.05),字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖4-e顯示，低濃度的Ca2+可以促進(jìn)生物膜的形成，高濃度則會(huì)抑制生物膜的形成，不同濃度的Ca2+對(duì)BS168與BS168-ΔsinR形成生物膜的能力相接近。當(dāng)Ca2+為0.01 mmol/L時(shí)，2株菌形成生物膜的OD570nm值最高。當(dāng)Ca2+濃度為10 mmol/L時(shí)，2株菌幾乎不形成生物膜。鈣對(duì)生物膜影響是可以通過生理依耐性吸附過程和生物膜形成的信號(hào)分子來產(chǎn)生[21]。

2.3 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下BS168與BS168-ΔsinR生物膜胞外多糖、胞外蛋白的含量

由圖5、圖6可知，不同培養(yǎng)條件下BS168-ΔsinR胞外多糖與胞外蛋白的相對(duì)含量均要高于BS168。2株菌在不同培養(yǎng)條件下胞外多糖與胞外蛋白的含量趨勢(shì)相一致，并且在一定的培養(yǎng)條件下重組菌胞外多糖與胞外蛋白含量顯著高于原始菌(P<0.05)。在Mn2+為0.01 mmol/L，F(xiàn)e2+為1 μmol/L，Ca2+為0.01 mmol/L時(shí)BS168、BS168-ΔsinR分別在溫度為37 ℃、pH值為7和溫度為40 ℃、pH值為8的條件下糖和蛋白含量處于最高值，表現(xiàn)出OD490nm和OD280nm值最高。這與生物膜的形成量幾乎吻合。生物膜的主要成分是由胞外蛋白與胞外多糖等組成，因此生物膜的含量會(huì)影響胞外多糖與胞外蛋白的含量。

圖5 不同生長(zhǎng)條件下生物膜胞外多糖含量Fig.5 Effects of different cultivated conditions on the concentration of exopolysaccharides

圖6 不同生長(zhǎng)條件對(duì)生物膜胞外蛋白的影響Fig.6 Effects of different cultivated conditions on concentration of extracellular proteins

2.4 不同溫度、pH及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下BS168與BS168-ΔsinR生物膜形成量與維生素K2生物合成量的比較

由圖7可知重組菌在相應(yīng)的溫度、pH、及Mn2+、Fe2+、Ca2+濃度下合成維生素K2的能力顯著高于出發(fā)菌株(P<0.05)。2株菌的維生素K2合成能力均與其生物膜的成膜能力密切相關(guān)。在生物膜成膜能力較強(qiáng)時(shí)，維生素K2的合成量也相對(duì)較高。

由圖7-a、圖7-b可知隨著溫度、pH的升高，2株菌生物膜的形成能力和維生素K2的合成能力均是先升后降，在溫度為37 ℃和40 ℃時(shí)菌株成膜能力佳，溫度為40 ℃時(shí)維生素K2的合成量達(dá)到最高，BS168維生素K2的合成量為56.5 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為88.6 mg/L；在pH值為8.0，生物膜形成量與維生素K2合成量均處于較高值，其中BS168維生素K2的合成量為53.2 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為97.3 mg/L。因此溫度為40 ℃、pH值為8.0是發(fā)酵過程中較為適合生物膜形成和維生素K2合成的條件。有趣的是BS168-ΔsinR在45 ℃ 時(shí)形成生物膜的OD570nm較高，但其維生素K2的合成量卻相對(duì)較低。我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期45 ℃培養(yǎng)條件下生物膜的溶解要早于其他的培養(yǎng)溫度，維生素K2是發(fā)酵后期的產(chǎn)物，所以生物膜的過早溶解可能會(huì)降低維生素K2的合成量。

圖7 不同生長(zhǎng)條件下維生素K2的測(cè)定Fig.7 Effects of different cultivated conditions on the concentration of formation of vitamin K2

由圖7-c可知,Mn2+為0.01 mmol/L時(shí)2株菌生物膜形成量最佳，在Mn2+為0.1 mmol/L時(shí)，維生素K2的合成量達(dá)到最高，BS168維生素K2的合成量為96.4 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為110.8 mg/L；由圖7-d可知，F(xiàn)e2+為1 μmol/L時(shí)，2株菌成膜能力最強(qiáng)；在Fe2+為50 μmol/L時(shí)，維生素K2的合成能力最強(qiáng)，其中BS168維生素K2的合成量為94.4 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為106.7 mg/L。由圖7-e可知，Ca2+為0.01 mmol/L時(shí)2株菌形成生物膜的OD570nm最高，在Ca2+為1 mmol/L 時(shí)，維生素K2的合成量最大，BS168維生素K2的合成量為85.3 mg/L，BS168-ΔsinR維生素K2的合成量為96.8 mg/L。在這3種金屬離子中添加Mn2+對(duì)于提高維生素K2產(chǎn)量最為明顯。其中BS168維生素K2的產(chǎn)量提高了73%。BS168-ΔsinR維生素K2的產(chǎn)量提高了44%。相比于BS168-ΔsinR，金屬離子的添加對(duì)BS168合成維生素K2的能力尤為明顯。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道維生素K2的產(chǎn)量與生物膜的形成量有關(guān)，添加適當(dāng)?shù)慕饘匐x子可以促進(jìn)生物膜的形成，但本實(shí)驗(yàn)中形成生物膜最佳的金屬離子濃度并不是合成維生素K2最高的金屬離子濃度。合成維生素K2最高的金屬離子濃度均要高于形成生物膜最佳時(shí)的金屬離子濃度。我們猜測(cè)金屬離子的添加可能會(huì)參與發(fā)酵后期相關(guān)代謝物的反應(yīng)，影響維生素K2合成的同時(shí)也影響了生物膜的形成。

3 結(jié)論

sinR是枯草芽胞桿菌生物膜形成的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它編碼的SinR蛋白與DNA的結(jié)合導(dǎo)致epsA-O和tapA-sipW-tasA操縱子的抑制[22-24]，這2個(gè)操縱子都參與生物膜基質(zhì)多糖和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生?？莶菅堪麠U菌BS168通過敲除生物膜形成的關(guān)鍵調(diào)控基因sinR，不僅增強(qiáng)了BS168-sinR菌株生物膜的形成能力，而且增強(qiáng)菌株在高溫和弱酸弱堿性環(huán)境的生長(zhǎng)能力和在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物維生素K2的合成能力。

近年來，有關(guān)枯草芽胞桿菌生物膜的研究主要通過分析培養(yǎng)條件(溫度、pH、金屬離子、接觸面材料性質(zhì)等)和生物膜形成的相關(guān)基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊戇M(jìn)行研究。對(duì)于提高維生素K2的產(chǎn)量，研究多集中在通過菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化以及代謝關(guān)鍵基因改造提高其產(chǎn)量[24-28]，對(duì)有關(guān)通過提高菌株生物膜的形成量來提高維生素K2的產(chǎn)量還未曾報(bào)道。因此本文通過培養(yǎng)條件和生物膜的關(guān)鍵調(diào)控基因與枯草芽胞桿菌BS168生物膜的形成作用進(jìn)行了分析，再進(jìn)一步比較其與維生素K2的生物合成量的關(guān)系。本研究結(jié)果為深入探究sinR基因參與枯草芽胞桿菌生物膜形成的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)及提高維生素K2合成產(chǎn)量提供參考依據(jù)。