丹白顆粒對(duì)宮腔粘連大鼠TGF-β/Smad信號(hào)通路及內(nèi)膜纖維化的影響

譚麗萍, 吳美麗, 任婧婧, 鞏 恒, 潘紅霞, 楊弋弋

(1.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 臨沂 276006 2.山東省青島市婦女兒童醫(yī)院婦科，山東 青島 266011 3.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院醫(yī)院婦科，河南 南陽(yáng) 473000)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)是由于子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致宮腔內(nèi)形成不規(guī)則的粘連，可引起經(jīng)血或?qū)m腔分泌物流通不暢，甚至完全受阻，產(chǎn)生經(jīng)血潴留、宮腔積液，從而引發(fā)痛經(jīng)、閉經(jīng)、繼發(fā)性感染、不育等[1,2]。IUA由子宮損傷、子宮感染等多種因素引起，其中流產(chǎn)清宮引發(fā)IUA最為常見(jiàn)，隨著人工流產(chǎn)率的增高，近年來(lái)IUA的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響現(xiàn)代女性的生育要求及生活質(zhì)量[3，4]。很多學(xué)者認(rèn)為子宮內(nèi)膜損傷過(guò)程中內(nèi)膜纖維化程度加深、纖維瘢痕組織的形成增多是IUA形成的可能機(jī)制[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(Transfer growth factor 1，TGF-β1)是TGF家族成員，與創(chuàng)面修復(fù)愈合密切相關(guān)，體內(nèi)高表達(dá)的TGF-β1對(duì)于纖維瘢痕組織的形成有促進(jìn)作用，是較強(qiáng)的促纖維化因子，Smad是TGF-β家族的信號(hào)傳導(dǎo)分子，TGF-β1活化后與Smad3相互識(shí)別，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在纖維瘢痕組織的形成中發(fā)揮重要作用[6]。目前關(guān)于IUA的治療主要是在宮腔鏡下行宮腔粘連分離術(shù)，但其復(fù)發(fā)率較高，因此探究可緩解IUA病情的藥物進(jìn)行早期治療仍是研究的熱點(diǎn)[7]。丹白顆粒中牡丹皮、大血藤、莪術(shù)、當(dāng)歸等藥物具有調(diào)經(jīng)止痛、活血化瘀、清熱解毒等功效，具有較強(qiáng)的活血、抗炎、抑菌等作用，適用于慢性盆腔炎等婦科疾病，但關(guān)于宮頸粘連的療效并不清晰。在查閱資料確定丹白顆粒具有清熱化瘀、祛濕止痛等功效后，本研究通過(guò)建立大鼠IUA模型，觀察丹白顆粒對(duì)IUA模型的影響，為丹白顆粒對(duì)于IUA的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物:SPF級(jí)健康SD雌性大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，約4月齡，體重為200～260g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：省科委2000A027。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，自然光照，溫度25℃，相對(duì)濕度55%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持動(dòng)物房環(huán)境整潔、每周清潔一次鼠籠、每天更新食物及飲用水。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2主要試劑及儀器:丹白顆粒(牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術(shù)、敗醬草、川芎、白芍、土茯苓、白英、白花蛇舌草、墓頭回、椿皮、當(dāng)歸，批號(hào)：Z20090651，規(guī)格8g/袋)購(gòu)于山東新時(shí)代藥業(yè)；蘇木素染液(批號(hào)：YYJK-923)、伊紅染液(批號(hào)：230251)、Masson染色試劑盒(批號(hào)：G1340)、羥脯氨酸試劑盒(批號(hào)：ml064306)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡(批號(hào)：325435)購(gòu)于上海普赫生物科技有限公司；TGF-β1、Smad3、Smad7、兔抗鼠單抗(貨號(hào)：ab08638、ab07994、ab07999)、羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：ab150077)、GAPDH(貨號(hào)：ab73299)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號(hào)P0027、P0011，)購(gòu)于上海碧云天公司；GIS-500凝膠成像儀(批號(hào)：1306412)購(gòu)于Miulab公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)XElx800)購(gòu)于美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3方 法

1.3.1動(dòng)物模型制備、分組給藥及實(shí)驗(yàn)分配:參考文獻(xiàn)[8]每日10∶00通過(guò)陰道脫落細(xì)胞法確定大鼠動(dòng)情周期，持續(xù)觀察7d，選取動(dòng)情期間的大鼠進(jìn)行手術(shù)，術(shù)前禁食不禁水12h。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(15只)和模型組(65只)，參考文獻(xiàn)[9]制備IUA模型，將醫(yī)用無(wú)菌手術(shù)線(xiàn)浸泡于脂多糖生理鹽水溶液(6mg/L)中24h備用，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)將大鼠麻醉后切開(kāi)大鼠下腹正中部位，找到大鼠“V”型子宮后于宮頸上方約5mm處作長(zhǎng)度約為4mm的切口，采用刮勺經(jīng)切口進(jìn)行刮宮手術(shù)，待宮腔表面有粗糙感時(shí)停止刮宮，將提前準(zhǔn)備好的脂多糖棉線(xiàn)放入大鼠宮腔內(nèi)加重感染，用生理鹽水沖洗宮腔后進(jìn)行縫合，24h后取出棉線(xiàn)，整個(gè)手術(shù)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，假手術(shù)組只做開(kāi)腹及子宮縫合手術(shù)。9d后建模結(jié)束，觀察到大鼠子宮呈現(xiàn)僵硬、扭曲，剖開(kāi)子宮腔后顯示管腔結(jié)構(gòu)消失即為模型構(gòu)建成功，本次實(shí)驗(yàn)造模成功60只，造模成功率為92.31%。預(yù)處理給藥劑量參照人體表面積法計(jì)算，成年人標(biāo)準(zhǔn)體重60kg，對(duì)應(yīng)給藥劑量為成人的6.25倍，成人每日給藥劑量為24g，則大鼠每日給藥劑量為2.5g/kg，因此設(shè)置低、中、高劑量藥物劑量為2.5、5.0、10.0g/kg。將建模成功的大鼠分為模型組、丹白低劑量組(2.5g·kg-1·d-1、丹白中劑量組(5.0g·kg-1·d-1)、丹白高劑量組(10.0g·kg-1·d-1)，每組15只。造模成功后24h開(kāi)始給藥，假手術(shù)組與模型組以等量生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃24d。選取5只大鼠的子宮組織進(jìn)行HE染色及Masson染色，另選5只大鼠的子宮組織進(jìn)行子宮腔的通透性評(píng)分和AFS評(píng)分，另選5只大鼠的子宮組織進(jìn)行膠原含量測(cè)定及TGF-β1/Smad3通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況測(cè)定。

1.3.2HE染色觀察大鼠子宮組織內(nèi)膜厚度、腺體數(shù)量:給藥結(jié)束后24h，每組選取5只大鼠進(jìn)行HE染色處理，將大鼠麻醉后處死，收集雙側(cè)子宮組織。將組織置于生理鹽水中漂洗干凈，采用4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)低濃度到高濃度梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后使用切片機(jī)進(jìn)行切片，得到常規(guī)病理切片，接著進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(或HE染色)，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。封片后于高倍鏡下選取5個(gè)視野記錄子宮內(nèi)膜腺體及子宮內(nèi)膜厚度，取平均值即為大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量及子宮內(nèi)膜厚度。

1.3.3子宮腔通暢性及AFS評(píng)分測(cè)定:選取5只大鼠參考文獻(xiàn)[10]測(cè)定大鼠子宮腔的通透性評(píng)分，將各組大鼠子宮摘除后置于白色濾紙上，用1mL注射器吸入約0.5mL的亞甲藍(lán)溶液，由子宮卵巢端向?qū)m腔內(nèi)推入，根據(jù)推入亞甲藍(lán)溶液所需的力度及溶液的的體積進(jìn)行綜合評(píng)分，子宮通暢性良好記為0分，通而不暢記為1分，完全不通暢記為2分。參考美國(guó)生育協(xié)會(huì)AFS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]評(píng)價(jià)大鼠的子宮粘連程度，分值越高粘連越嚴(yán)重。

1.3.4Masson法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度:每組選取5只大鼠，對(duì)子宮組織行Masson染色，將石蠟切片脫蠟、蘇木精染核、Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色、冰醋酸溶液浸洗、磷鉬酸水溶液分化、苯胺藍(lán)染色、經(jīng)酒精沖洗、二甲苯透明、封片，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。封片后于高倍鏡下選取5個(gè)視野計(jì)算子宮內(nèi)膜纖維化面積比，即子宮內(nèi)膜纖維化面積與所選視野總面積之比。

1.3.5ELISA法檢測(cè)大鼠子宮組織膠原含量:將50mg大鼠子宮組織剪碎后加入胃蛋白酶(5mg/mL)和三氯乙酸(0.5moL/L)消化(4℃，過(guò)夜)，離心后的上清液中含有可溶性膠原，沉淀中含有不溶性膠原，根據(jù)羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求測(cè)定并計(jì)算上清液中羥脯氨酸的含量，以羥脯氨酸的含量反映可溶性膠原的含量。另取50mg大鼠子宮組織剪碎后加入水解液，再根據(jù)羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行測(cè)定，以得出總膠原含量，二者的差值即為不溶膠原含量。

1.3.6Western blot法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1/Smad3通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況:每組選取5只大鼠，采用蛋白提取試劑盒提取大鼠子宮內(nèi)膜組織中的總蛋白，參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求測(cè)定蛋白濃度，8%分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，脫脂奶粉(5%)封閉1h后添加兔抗鼠TGF-β1、Smad3、Smad7一抗、內(nèi)參GAPDH(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌后添加羊抗兔IgG二抗(1∶5000)，室溫孵育2h。采用蛋白成像凝膠儀對(duì)TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白水平進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠子宮組織病理形態(tài)比較:HE染色切片顯示，假手術(shù)組大鼠宮腔通暢、腔壁組織結(jié)構(gòu)清晰完整；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠宮腔消失、腔壁組織呈現(xiàn)粘連狀態(tài)、較多炎性細(xì)胞呈現(xiàn)浸潤(rùn)狀態(tài)；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組均有一定的改善，其中高劑量組宮腔較為通暢。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠子宮組織HE染色結(jié)果(×400)

2.2丹白顆粒對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜厚度、腺體數(shù)量、子宮通暢性、AFS評(píng)分的影響：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量顯著降低，子宮通暢性評(píng)分、AFS評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組大鼠子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量顯著升高，子宮通暢性得到緩解(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 丹白顆粒對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜厚度腺體數(shù)量子宮通暢性的影響

2.3丹白顆粒對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度和子宮膠原含量的影響：與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積及子宮組織中的不可溶性膠原含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組子宮內(nèi)膜纖維化面積及不可溶性膠原含量顯著降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 大鼠子宮組織Masson染色結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度及膠原含量比較

2.4丹白顆粒對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1/Smad3通路蛋白表達(dá)的影響：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)(P<0.05)，丹白顆粒各劑量組呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1/Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜TGF-β1/Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討 論

IUA主要發(fā)生在育齡期女性，是常見(jiàn)的婦科疾病之一，且發(fā)病率逐年上升。子宮基底膜受到損傷后導(dǎo)致基層暴露，創(chuàng)面的膠原蛋白、炎癥因子等會(huì)滲出，宮腔內(nèi)壁發(fā)生一定的接觸，在子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中會(huì)形成纖維帶，進(jìn)而產(chǎn)生IUA，常會(huì)導(dǎo)致閉經(jīng)、少經(jīng)、痛經(jīng)等不良癥狀[12]，子宮內(nèi)膜損傷引起的宮腔形態(tài)異常會(huì)導(dǎo)致不孕、胚胎發(fā)育停止、產(chǎn)后大出血、胎盤(pán)粘連等不良妊娠癥狀，對(duì)于女性的身體健康及生育產(chǎn)生重大影響[13]。子宮內(nèi)膜損傷是發(fā)生IUA的主要原因，因此建立有效的IUA大鼠模型在IUA疾病發(fā)生發(fā)展研究中占有重要地位。Kong[14]及王顯[15]等通過(guò)機(jī)械性刮除及感染性損傷建立大鼠IUA模型效果較好，IUA模型大鼠的子宮內(nèi)膜纖維化程度加深、腺體數(shù)量顯著減少、TGF-β1表達(dá)顯著升高。本研究通過(guò)子宮內(nèi)膜搔刮后用脂多糖加重感染的多重?fù)p傷法構(gòu)建大鼠模型，研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腔壁組織呈現(xiàn)不同程度的粘連狀態(tài)，子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量顯著降低，子宮通暢性評(píng)分、AFS評(píng)分、子宮不可溶性膠原含量、子宮內(nèi)膜纖維化面積顯著升高，表明模型組大鼠子宮受損嚴(yán)重、宮腔粘連嚴(yán)重、內(nèi)膜纖維化程度較深，揭示IUA模型構(gòu)建成功。

研究發(fā)現(xiàn)IUA與子宮內(nèi)膜纖維化、宮腔損傷、熱淤內(nèi)結(jié)等聯(lián)系密切，子宮內(nèi)膜受損后，在修復(fù)過(guò)程中會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、成纖維細(xì)胞的分泌及不溶性膠原的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致宮腔內(nèi)較多纖維瘢痕組織的生成，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的纖維化，進(jìn)而產(chǎn)生宮腔內(nèi)壁粘連[16]，基于丹白顆粒的活血化瘀、祛濕止痛的功效，本文用丹白顆粒處理IUA大鼠，研究丹白顆粒對(duì)IUA的治療效果。研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，經(jīng)過(guò)丹白顆粒處理過(guò)的大鼠子宮內(nèi)膜厚度、腺體數(shù)量有一定的回升，子宮通暢性、子宮內(nèi)膜纖維化程度得到緩解，不可溶性膠原含量顯著降低，表明丹白顆粒具有緩解子宮受損及子宮內(nèi)膜纖維化的作用，對(duì)于治療IUA可能具有較好的療效，但其具體機(jī)制尚不清晰。

Zhang[17]等研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林通過(guò)抑制TGF-β1-Smad2/Smad3通路抑制子宮內(nèi)膜纖維化，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)IUA的治療作用，李燦宇[18]等研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1是有效的促纖維化因子，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及成纖維細(xì)胞的生成，可介導(dǎo)組織纖維化和纖維瘢痕組織的生成，在多種纖維化疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)，Smad3是TGF-β1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Smad3的高表達(dá)可促進(jìn)纖維細(xì)胞膠原的合成，加重宮腔粘連程度。Smad7的表達(dá)增加會(huì)阻斷TGF-β1與Smad3的結(jié)合，進(jìn)而起到抗纖維化的作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組Smad7蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)，與相關(guān)研究結(jié)果一致，表明丹白顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制TGF-β1/Smad3通路活化，進(jìn)而發(fā)揮抗IUA子宮內(nèi)膜纖維化的作用。

綜上所述，丹白顆粒可有效緩解IUA大鼠引起的子宮內(nèi)膜纖維化程度，可能與抑制TGF-β/Smad通路有關(guān)，但是本研究未進(jìn)行通路抑制劑及激活劑進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，仍需深入研究。