血清HMGB1 miR-200c-3p及cTnⅠ水平對(duì)新生兒呼吸窘迫綜合征預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

霍惠儀，盧泳雪

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院新生兒科，廣東 佛山 528000)

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是指新生兒出生不久即出現(xiàn)的由于原發(fā)或繼發(fā)的肺泡表面活性物質(zhì)減少導(dǎo)致的進(jìn)行性呼吸疾病，表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸衰竭，呻吟發(fā)紺吸氣三凹征[1,2]。具有病情嚴(yán)重、發(fā)展快速、死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅新生兒生命，且經(jīng)搶救存活的患兒肺功能與神經(jīng)系統(tǒng)亦受損害，對(duì)未來生長(zhǎng)發(fā)造成影響[3]。因此尋找簡(jiǎn)單有效的評(píng)估指標(biāo)對(duì)NRDS進(jìn)行病情與預(yù)后評(píng)估十分重要。研究表明：炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子在NRDS的病例發(fā)展中有重要作用[4]?；诖?，本研究旨在探究血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平對(duì)NRDS預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為預(yù)防和降低NRDS風(fēng)險(xiǎn)提供參考，現(xiàn)將研究成果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年1月至2019年12月本院收治的NRDS患兒120例，根據(jù)患者病情分為輕度組(胸片結(jié)果為Ⅰ、Ⅱ級(jí))、重度組(胸片結(jié)果為Ⅲ、Ⅳ級(jí))，各72、48例。另選取同期本院產(chǎn)科出生正常新生兒40例為對(duì)照組。其中輕度組患兒男性35例、女性37例，胎齡32～40周，平均(35.28±2.57)周，出生體重1.5～5.1kg，平均(2.58±0.85)kg，自然分娩38例、剖宮產(chǎn)34例；重度組患兒男性22例、女性26例，胎齡31～40周，平均(34.69±2.23)周，出生體重1.5～5.2kg，平均(2.38±0.93)kg，自然分娩21例、剖宮產(chǎn)27例；對(duì)照組患兒男性19例、女性21例，胎齡33～39周，平均(35.87±1.01)周，出生體重2.5～4.5kg，平均(3.02±0.35)kg，自然分娩23例、剖宮產(chǎn)17例。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)我院診斷確診的NRDS患兒，符合《實(shí)用新生兒學(xué)》的標(biāo)準(zhǔn)；②出生不久出現(xiàn)呼吸進(jìn)行性困難，呻吟吸氣發(fā)紺三凹征；③X線胸片檢查表現(xiàn)為雙肺彌漫性陰影、毛玻璃顆粒狀，透明度降低，無心房高壓；④患者臨床資料完整；⑤動(dòng)脈氣血分析提示血氧下降，二氧化碳分壓上升。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺外嚴(yán)重感染患兒；②先天性臟病、代謝紊亂患兒；③肺怕表面原發(fā)性活物缺乏患兒；④先天畸形、肺和胸壁畸形患兒。本研究征得院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3方 法

1.3.1臨床資料：入院后收集患兒一般資料，包括年齡，入院胎齡、體重、分娩方式、及母親相關(guān)資料等。

1.3.2樣本采集：采集新生兒出生后6h內(nèi)的外周靜脈血5mL，置于凝管中靜置30min，離心(3000rpm/min)10min后裝于EP管中，于-80℃下保存?zhèn)錅y(cè)。①使用用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)血清HMGB1水平。②根據(jù)逆轉(zhuǎn)試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)錄定量RNA，內(nèi)參U6；反應(yīng)體系(15 μL)：無菌三蒸水(4.16 μL)、U6及miRNA特異性莖環(huán)引物(3 μL)、10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(1.50 μL)、RNA模板(5μL)、50U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶(1.00μL)、20U/μL RNase抑制劑(0.19μL)、100mmoL/L脫氧核糖核苷酸(0.15μL)。反映參數(shù)：分別于16℃、42℃、85℃中反應(yīng)30min、30min、5min，于4℃恒溫放置，每1個(gè)循環(huán)1反應(yīng)。在熒光定量PCR儀上(ABI熒光定量?jī)xQubit4.0南京貝登電子商務(wù)有限公司)進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)體系(20μL)：TaqMan通用混合物溶液(10μL)、無核酸酶水(7.67μL)、引物及20×探針Mix(1μL)、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1.33μL)；擴(kuò)增條件：分別于95℃、95℃、60℃中進(jìn)行預(yù)變性、變性、復(fù)性循環(huán)，次數(shù)為1個(gè)、45個(gè)、45個(gè)，每個(gè)循環(huán)分別進(jìn)行10min、15s、60s。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，miR-200c-3p水平表達(dá)相對(duì)值采用2-ΔΔCt法計(jì)算。③靜脈血離心11min后取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀(濟(jì)南童鑫生物科技有限公司)檢測(cè)cTnⅠ水平，參考值為0.02～0.13ng/mL。所有實(shí)驗(yàn)試劑盒均供自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4觀察指標(biāo):NRDS影像分級(jí)[5]：Ⅰ級(jí)：雙肺透亮度減低，可見均勻網(wǎng)狀陰影與細(xì)小顆粒；Ⅱ級(jí)：病變至肺野中外帶，且有支氣管充氣征；Ⅲ級(jí)：雙肺透亮度明顯降低，病變加深，出現(xiàn)膈面、心緣模糊；Ⅳ級(jí)：雙肺呈白肺狀，支氣管充氣征嚴(yán)重似禿葉樹枝。

2 結(jié) 果

2.1三組血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較:結(jié)果顯示：三組在血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較存在明顯差異(P<0.05)，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平重度組>輕度組>對(duì)照組，見表1。

表1 三組患者血清HMGB1 miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較

2.2兩組NRDS患者臨床資料比較:住院期間，120例NRDS患者共34例(28.33%)死亡，86例(71.67%)存活。其中死亡患者中，輕度組5例、重度組29例。兩組患者的年齡、性別、出生體重、母親年齡、剖宮產(chǎn)、出現(xiàn)呼吸困難時(shí)間、母親糖尿病、母親高血壓、胎糞吸入、宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、等相比較均無明顯差異(P>0.05)，但兩組在病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平的差異間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者臨床資料比較

2.3NRDS患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析：以“死亡組”為因變量(賦值：0=是，1=否)，以“病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平”為自變量，納入Logistic回歸分析。多因素Logistic回歸分析顯示病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平均為NRDS患者預(yù)后的相關(guān)影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 NRDS患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平與三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)NRDS患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值:ROC曲線分析顯示，HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平對(duì)NRDS患者的預(yù)測(cè)的AUC為0.933、0.892、0.766，具有較高準(zhǔn)確性；以約登指數(shù)的最大切點(diǎn)作為最佳臨界值，該點(diǎn)預(yù)測(cè)，HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平敏感度、特異度：為91.2%82.4%/50.0%、91.9%/100.0%100.0%，預(yù)測(cè)具有較高價(jià)值。將HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平納入Logistic回歸模型，通過三項(xiàng)指標(biāo)的logistic回歸模型得出三項(xiàng)聯(lián)合的數(shù)值：計(jì)算公式為：三項(xiàng)聯(lián)合=14.224+(-0.019)*HMGB1+(-1.011)*miR-200c-3p+(-12.049)*cTnⅠ，統(tǒng)計(jì)分析得出聯(lián)合數(shù)據(jù)。進(jìn)一步ROC曲線顯示，三項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)AUC為0.937，敏感度、特異度為82.4%、98.8%，預(yù)測(cè)價(jià)值較高。見表4、5，圖1。

表4 HMGB1 miR-200c-3p cTnⅠ水平與三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)NRDS患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

表5 HMGB1 miR-200c-3p cTnⅠ水平與三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)NRDS患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值的效能分析

圖1 HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平與三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)NRDS患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

NRDS病發(fā)高危因素包括早產(chǎn)，肺表面活性物質(zhì)缺乏、缺氧、炎癥反應(yīng)等，使多種因素共同參與的結(jié)果。通常情況下，新生兒肺功能成熟度較低，肺表面活性物質(zhì)較少，NRDS病發(fā)時(shí)易病發(fā)肺炎，使病情加重，影響預(yù)后生存[6]。

血清HMGB1是炎性介質(zhì)的一種，通過免疫細(xì)胞分泌釋放入胞漿與胞外，參與肺損傷炎癥反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)作用。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是新型基因調(diào)控因子，可通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)參與炎癥通路與免疫應(yīng)答調(diào)控[7]。心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)是評(píng)價(jià)心肌損傷與預(yù)后轉(zhuǎn)歸的生化常用指標(biāo)。本研究通過將輕度NRDS患兒，重度NRDS患者與健康組對(duì)比，結(jié)果顯示：血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平重度組>輕度組>對(duì)照組。提示NRDS患兒病發(fā)體內(nèi)血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平呈現(xiàn)高表達(dá)，隨病情加重，表達(dá)水平數(shù)值升高，可將HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平作為NRDS診斷新靶點(diǎn)。分析原因?yàn)閇8]：①NRDS病發(fā)時(shí)，肺功能發(fā)生障礙，出現(xiàn)缺氧癥狀，引發(fā)肺血管損傷，大量炎性因子釋放，HMGB1升高；②miRNA在NRDS病發(fā)炎癥反應(yīng)中，參與表皮細(xì)胞病理過程，在細(xì)胞分化凋亡血管生成中發(fā)揮重要作用；③新生兒心肌細(xì)胞對(duì)缺氧敏感度高，NRDS患兒病發(fā)缺氧且伴隨炎癥反應(yīng)，增加肺循環(huán)阻力，導(dǎo)致循環(huán)障礙與代謝異常，增加心肌細(xì)胞通透性，造成心肌缺氧損傷，cTnⅠ水平上升。且病情越嚴(yán)重，心肌缺氧損傷越重，cTnⅠ水平越高。

本研究預(yù)后情況：住院期間，120例NRDS患兒共34例(28.33%)死亡，86例(71.67%)存活，通過對(duì)比生存死亡組資料，結(jié)果顯示，兩組患者在血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平存在差異，死亡組顯著高于生存組，與上文所述具有一致性，患兒病情加重，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平皆呈現(xiàn)高表達(dá)。有研究表明：HMGB1、miR-200c-3p參與NRDS細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且患兒病情加重，炎癥與心損加重，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平升高，與本文結(jié)論一致[9]。另ROC曲線顯示，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平對(duì)NRDS患兒的預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值，且聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。分析原因?yàn)椋貉錒MGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平與NRDS患兒病情嚴(yán)重程度相關(guān)密切，可作為預(yù)后標(biāo)志物。王文秀研究亦表明：巨噬細(xì)胞活化后4h產(chǎn)生HMGB1，18-24達(dá)高峰，能一段時(shí)間內(nèi)存于體內(nèi)，參與肺損傷等炎癥反應(yīng)，且具有警報(bào)素功能，濃度高低可反應(yīng)病情、組織損傷程度，與預(yù)后相關(guān)密切[10]。

綜上所述，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平在NRDS患兒中呈高表達(dá)，且與病情程度相關(guān)密切，具有較高的預(yù)后預(yù)測(cè)評(píng)估價(jià)值。