養(yǎng)心定悸膠囊在缺血再灌注損傷心肌組織中的保護(hù)作用研究

王 靜，賈凌梅，劉 暢，欒瑩瑩，賈 敏

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊 050027 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

心肌缺血再灌注損傷是臨床經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等治療動脈粥樣硬化，心肌梗死等疾病中的常發(fā)的并發(fā)癥，嚴(yán)重的心肌缺血再灌注損傷可以二次導(dǎo)致心肌冠狀動脈血供不足和多種臨床心血管并發(fā)癥[1，2]。缺血/再灌注(I/R)可導(dǎo)致血管功能、代謝和結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生。大量的證據(jù)表明細(xì)胞溶質(zhì)鈣超載和氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血/再灌注心肌缺血損傷中扮演重要作用[3]。內(nèi)源性活性氧參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的生物過程，正常條件下機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)可以平衡體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，但在異常條件下，機(jī)體的抗氧化機(jī)制破壞，過度釋放的氧自由基，氮自由基可誘導(dǎo)組織損傷發(fā)生，導(dǎo)致線粒體的鈣超載。氮代謝異常導(dǎo)致的氮自由基過量是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的中除了氧自由基外的另一種重要因子可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體蛋白的修飾，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著并引起線粒體的電勢的改變，最終引起線粒體損傷的發(fā)生[4]。因此改善氮自由基過量以及由其導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)及線粒體損傷在心肌缺血再灌注損傷中具有重要作用。養(yǎng)心定悸膠囊，由地黃、麥冬、紅參、大棗、阿膠、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草組成。具有養(yǎng)血益氣，復(fù)脈定悸的功效。用于氣虛血少，心悸氣短，心律不齊，盜汗失眠，咽干舌燥，大便干結(jié)[5]。該藥臨床對于快速性和緩慢性心律失常均有良好的治療效果，其能夠雙向調(diào)節(jié)心律，提高心功能，改善心率變異性和血管內(nèi)皮功能。且改善心慌、氣短、乏力、失眠等癥狀。前期的研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心定悸膠囊在改善心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)的心率失常中具有一定作用，同時(shí)對心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生具有一定保護(hù)作用[6]。氮自由基氮代謝異常是導(dǎo)致心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，而養(yǎng)心定悸膠囊具有改善氧化應(yīng)激的作用，但其對心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)對機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響作用還有待闡明。因此本研究將建立心肌缺血再灌注模型，考察養(yǎng)心定悸膠囊在心肌缺血再灌注損傷中對機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)及心肌氮代謝的影響及調(diào)控機(jī)制。

1 材料及方法

1.1試劑及儀器:養(yǎng)心定悸膠囊購自石藥集團(tuán)，SOD，GSH-px，MDA(南京建成生物工程公司)；線粒體提取試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，中國)；異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)，α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)ELISA試劑盒(sigma，美國)；鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)ELISA試劑盒(sigma，美國)。Mpre200酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物及模型建立:采用Langendorff離體心臟灌流建立大鼠缺血再灌流損傷模型，大鼠腹腔注射肝素1000U/kg抗凝后，戊巴比妥鈉麻醉。迅速取出心臟，清洗殘留血液后心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，逆行恒壓灌注。剪開右心房，冠脈流出液自然流出。恒溫(37℃)、恒壓(100cm H2O)條件下采用95%O2+5%CO2混合氣飽和的K-H緩沖液(pH值7.35～7.40)灌注。剪開左心耳，將連接有測壓導(dǎo)管的心室球囊送入左心室，另一端連接多導(dǎo)生理記錄儀。灌注液及心臟周圍溫度用恒溫循環(huán)水浴維持在37℃±0.5℃。平衡灌注30min，待心臟各項(xiàng)功能穩(wěn)定，關(guān)閉灌流液停止灌流，造成全心缺血，30min后打開灌流液再復(fù)灌30min。將30只大鼠分為正常對照組、模型組、停灌前給藥低、中、高劑量干預(yù)組、，每組6只。將養(yǎng)心定悸膠囊溶于灌流液中，采用0.45μm微孔濾膜過濾，使終濃度分別為0.05g/L、0.2g/L、0.5g/L。給藥劑量參照臨床用量分別設(shè)置高、中、低劑量并按照體表面積折算。正常對照組用正常灌流液灌注。模型組用正常灌流液灌注，平衡30min后，停止灌注30min，復(fù)灌30min。停灌前給藥組：正常灌流平衡20min后，分別用含有不同劑量的含藥灌流液灌注10min后，停止灌注30min，復(fù)灌30min。

1.3乳酸脫氫酶及肌酸激酶同工酶活性分析:心肌細(xì)胞損傷通過測量冠狀動脈內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，采用商業(yè)試劑盒，按照試劑盒說明書，取200μg冠狀動脈，加入PBS勻漿后檢測(Agappediagnostics，印度)。

1.4抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量檢測:取心肌組織100mg檢測心臟抗氧化酶測定和脂質(zhì)過氧化含量及活性，測定采用分光光度計(jì)檢測。超氧化物歧化酶測定SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)采用試劑盒說明書方法檢測?？偟鞍撞捎肔owry等人的方法進(jìn)行分析。水平硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)和脂質(zhì)過氧化物(LOOH)按照說明書檢測。

1.5多胺含量測定:心肌組織中腐胺、精胺、多胺含量采用高效液相色譜法(LC-6A，島津，高效液相色譜法(LC-6A，島津，日本)。心臟樣本用0.3M冰冷高氯酸，苯甲酰氯進(jìn)行衍生化，苯甲酰氯衍生物用氯仿萃取。衍生物用超高密度ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm，水，美國)分離。柱洗脫液用紫外檢測器在229nm監(jiān)測(安捷倫1200，安捷倫公司)。

1.6鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)活性檢測:心肌組織在4℃下勻漿的等分，以30000×g離心20min分別測定ODC和SSAT活性。ODC活性通過測定37℃下0.5μCi的L-[1-14C]鳥氨酸釋放的14CO2量來測量?；旌衔镌?7℃下培養(yǎng)60min。通過添加0.8mL 1mM檸檬酸，繼續(xù)培養(yǎng)20min。ODC活性以pmol/mg蛋白質(zhì)表示。將86μl勻漿液添加到含有100mM的反應(yīng)混合物中Tris-HCl(pH7.8)，3mM亞精胺(pH7.0)，1mM二硫蘇糖醇。然后將該混合物在37℃下培養(yǎng)10min。通過添加20μM鹽酸羥胺進(jìn)行測定，以22000×g離心5min后檢測。

1.7NO及ONOO-含量檢測:組織用二氫乙胺(DHE，Cat)孵育。37min并小心地清洗冷PBS兩次以去除多余的DHE。用研缽和杵將碎片粉碎液氮。用抹刀將粉末轉(zhuǎn)移到試管中，加入乙腈。組織樣本離心后，上清液在室溫下轉(zhuǎn)移并在真空濃縮器中干燥。沉淀層在含有0.1%Triton X-100的溶解緩沖液(Dulbecco's PBS，pH值)中溶解，用BCA蛋白試劑盒(Cat。P0012號，碧云天生物科技，上海，中國)。初始流動相(60μ五十)在渦流前加入干燥樣品注入10μL放入帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀。條件是：λ發(fā)射=580nm和λ激發(fā)=480nm，柱溫25℃帶進(jìn)樣量20μL。流動相為90% H2O～10%CH3CN(0.1%三氟乙酸)，流速為1.0mL/min。HPLC柱為Agilent 5 TC-C18。

1.8線粒體相關(guān)代謝酶活性檢測:異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)，α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)按照試劑盒檢測說明檢測。取模型鼠心肌組織100mg，勻漿后，采用梯度離心法分離模型鼠線粒體分離，檢測心肌組織相關(guān)酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)值表述為均值±標(biāo)準(zhǔn)差,使用SPSS11.5版對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中LDH，CK-MB水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織損傷的發(fā)生，LDH、CK-MB是考察心肌組織損傷的經(jīng)典標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組LDH、CK-MB水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著升高，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)的心肌組織中LDH，CK-MB活性有下降趨勢，中、高劑量養(yǎng)心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的LDH，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)中，高劑量組養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后CK-MB活性與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織LDH CK-MB水平的影響

2.2養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織損傷的發(fā)生，氧化應(yīng)激反應(yīng)是心肌組織損傷的顯著誘因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組抗氧化酶SOD、CAT、GPx水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著降低，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)的心肌組織中SOD、CAT、GPx活性明顯改善，高劑量養(yǎng)心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的CAT、GPx水平，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)中，高劑量組養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后SOD活性與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此外模型組脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS、LOOH含量顯著升高，而養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后模型鼠組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平顯著降低與模型鼠具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平的影響

2.3養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)活性水平的影響:缺血再灌注可以導(dǎo)致心肌組織ODC和SSAT活性水平顯著升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組ODC和SSAT水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)的心肌組織中ODC和SSAT活性呈下降趨勢，高劑量養(yǎng)心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的ODC，與模型組，低劑量組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)中，高劑量組養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后SSAT活性與模型組，低劑量干預(yù)組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

表3 養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多鳥氨酸脫羧酶和亞精胺/精胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性水平的影響

2.4養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多胺，NO及ONOO-水平的影響：多胺類物質(zhì)是考察心肌組織損傷的經(jīng)典標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組腐胺，精胺，多胺水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著升高，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)的心肌組織中腐胺，精胺，多胺含量均顯著下降趨勢。中、高劑量養(yǎng)心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的精胺、多胺，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)高劑量組養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后腐胺含量與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。NO及ONOO-含量與胺含量相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組NO水平顯著降低，ONOO-含量明顯升高，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后，組織中NO水平顯著升高，且可抑制ONOO-含量的升高，中高劑量養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)均有顯著作用(P<0.05)。見表4。

表4 養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多胺及NO及ONOO-含量水平的影響

2.5養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中線粒體相關(guān)代謝酶活性水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織能量供應(yīng)障礙，線粒體TCA循環(huán)功能障礙的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組線粒體關(guān)鍵物質(zhì)代謝酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均顯著降低水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，而給與養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后，檢測心肌組織中ICDH、SDH、MDH、α-KGDH，結(jié)果表明，養(yǎng)心定悸膠囊對線粒體TCA循環(huán)關(guān)鍵代謝酶活性具有一定的改善作用，中、高劑量養(yǎng)心定悸膠囊可以顯升高心肌組織中的ICDH、MDH、α-KGDH活性，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)高劑量組養(yǎng)心定悸膠囊干預(yù)后SDH活性與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表5。

表5 養(yǎng)心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中線粒體相關(guān)代謝酶活性水平的影響

3 討 論

心肌缺血可導(dǎo)致線粒體ATP的消耗，而再灌注導(dǎo)致活性氧中間體和鈣的生產(chǎn)超載，細(xì)胞代謝和生成的毒性分子導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生。心肌組織中氧，氮自由基的產(chǎn)生和鈣超載是心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)主要原因，是與其疾病發(fā)展有關(guān)的重要病理生理學(xué)事件[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)缺血再灌注心肌組織損傷性標(biāo)志物，LDH、CK-MB水平明顯升高，缺血再灌注心肌組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物TBARS、LOOH含量明顯升高與正常組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，心肌組織抗氧化酶GPx、SOD、CAT活性顯著降低與正常組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

多胺(精胺、亞精胺和腐胺)是所有真核細(xì)胞的固有成分，是機(jī)體含氮的主要內(nèi)源性物質(zhì)。它們在細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞生長和分化、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變和胞漿鈣穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[8]。多胺可參與組織缺血損傷中，如腦缺血、腎臟缺血等缺血/再灌注損傷。鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N1乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)分別是多胺生物合成和降解的關(guān)鍵酶。ODC將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為腐胺，腐胺被代謝為精胺和亞精胺。SSAT乙?；泛蛠喚沸纬梢阴；喟贰Ｒ阴；喟繁欢喟费趸?PAO)轉(zhuǎn)化為腐胺，在這個(gè)過程中，過氧化氫(H2O2)和氨基丙醛大量生成[9]。研究表明心肌缺血/再灌注損傷大鼠，多胺合成和降解中的關(guān)鍵酶ODC和SSAT活性水平顯著升高。導(dǎo)致心肌組織含氮的多胺類物質(zhì)代謝異常，繼而引起心肌氮自由基含量升高，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒損傷發(fā)生，此外一氧化氮(NO)是調(diào)控機(jī)體血管功能的關(guān)鍵內(nèi)源性物質(zhì)。其也可與超氧物反應(yīng)可生成過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)，而ONOO-可導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生，損傷血管等組織。研究發(fā)現(xiàn)多胺與和NO通路相互影響。有研究表明NO通過抑制ODC活性在改善動脈粥樣硬化[10]。而多胺的大量產(chǎn)生可導(dǎo)致NO氧化為ONOO-加劇血管損傷的發(fā)生[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠模型中，心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯加劇ODC和SSAT活性水平，促進(jìn)機(jī)體多胺的產(chǎn)生，而養(yǎng)心定悸膠囊可明顯改善其作用，降低機(jī)體多胺類物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)減少機(jī)體ONOO-含量，恢復(fù)NO含量，改善血管功能。線粒體能量代謝的改變是心肌損傷的關(guān)鍵因素。氮代謝異?？蓪?dǎo)致線粒體損傷的發(fā)生，而本研究中發(fā)現(xiàn)缺血再灌注可以導(dǎo)致心肌心肌組織中線粒體相關(guān)代謝酶活性水平的顯著減低，線粒體關(guān)鍵物質(zhì)代謝酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均顯著降低。而養(yǎng)心定悸膠囊在中，高劑量組干預(yù)后，大鼠心肌組織中線粒體能量代謝能力顯著改善。檸檬酸鹽脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)是參與線粒體TCA循環(huán)產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵活性酶。而養(yǎng)心定悸膠囊可顯著改善其活性，因此有助于線粒體的能量生成。養(yǎng)心定悸膠囊，由地黃、麥冬、紅參、大棗、阿膠、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草組成，其中研究表明大棗能明顯阻斷N二甲基亞硝胺的形成，不同配比的芍藥炙甘草可以改變機(jī)體NO含量[12]，以上藥材可能參與機(jī)體氮代謝的影響，但是目前針對其主要藥材及其活性成分對心肌缺血再灌注損傷機(jī)體氮代謝調(diào)控的研究尚未報(bào)道。

本研究表明養(yǎng)心定悸膠囊可顯著改善缺血再灌注損傷心肌組織氮代謝異常，減少心肌組織胺類物質(zhì)含量，減少氮自由基，恢復(fù)心肌組織線粒體能量代謝，但是養(yǎng)心定悸膠囊參與調(diào)控ODC和SSAT活性的分子機(jī)制還有待闡明。本研究對于將養(yǎng)心定悸膠囊用于動脈粥樣硬化治療提供了一定的前期基礎(chǔ)，但其后期還有待進(jìn)一步開展相關(guān)臨床研究。