絲蛋白-羥基磷灰石復合材料通過抑制NF-κB/NLRP3促進骨缺損的修復

李石巖，李燕波，曹 雷，郝旭峰，何志良，張 晗，王承陽，高 玥，蘇丹妮

(河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000)

骨具有固有的再生能力，但在許多情況下，仍需要改善骨修復能力的策略。骨再生取決于骨缺損類型。例如，大約10%的骨缺損是不愈合的，不能自發(fā)愈合，導致骨組織再生不當和延遲愈合。因此，為了提高骨再生能力，避免上述局限性，人們進行了許多嘗試，以開發(fā)出合適的由天然或合成生物材料組成的骨結構。一些聚合物由于其生物相容性、可生物降解性、可調(diào)節(jié)的結構特性和易于制造，因此通常是很好的候選材料。可降解聚合物對于這些類型的修復非常重要，以避免阻礙骨的完全再生，可降解聚合物分為天然聚合物，如海藻酸鹽、殼聚糖、膠原蛋白、絲和合成聚合物，包括聚二氧六環(huán)酮(polydioxanone，PDS)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)，和聚乳酸-羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)。近年來，由于其獨特的生物相容性、多功能性和生物降解性，天然聚合物在骨組織工程中的應用越來越受到重視。這些類型的聚合物提供了由配體組成的圖案良好的結構，這些配體可以與細胞表面受體結合或提供可進入的酶降解位點[2]。

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種天然纖維聚合物，在生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用前景。SF因其具有彈性、柔韌性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)異特性，在骨組織工程領域引起了廣泛的關注。近年來，各種各樣的研究也集中在天然聚合物和SF在骨修復中的應用。雖然其中一些聚合物具有骨再生的內(nèi)在能力，但這不足以修復大面積骨缺損。因此，在聚合物基質(zhì)中加入顆粒有助于改善支架的力學性能和調(diào)整支架的地形特征，從而模擬自然骨的結構[3]。

然而，SF必須進行功能化后方可發(fā)揮上述作用，否則低成骨能力限制了SF在骨科領域的應用。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是一種成熟的生物陶瓷，具有與骨組織相似的性質(zhì)和良好的生物相容性，是一種可與不同聚合物相結合的生物陶瓷相[4]。然而，HA陶瓷易脆化，限制了其在骨修復中的應用[5]。幾種天然聚合物，包括膠原蛋白、明膠、殼聚糖和蠶絲，已與HA結合使用，以促進骨再生[6]。因此，將SF和HA共混，結合了這兩種材料作為組織工程骨結構的優(yōu)異特性，基于SF/HA復合材料用于骨組織再生值得深入探討。

急慢性炎癥在骨修復過程中起著不可缺的作用。炎癥細胞(多形核白細胞和單核-巨噬細胞-破骨細胞系細胞)和與骨愈合相關的細胞(間充質(zhì)干細胞-成骨細胞系和血管系細胞)之間的串擾對骨的形成、修復和重塑至關重要[7]。炎性小體(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)是一種細胞內(nèi)機制，激活的NLRP3可分泌IL-1β和IL-18，繼而介導炎癥反應。研究表明，抑制NLRP3炎性小體促進糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合[8]。但在SF/HA復合材料應用過程中對NLRP3的作用尚不明確。

本研究旨在探討絲蛋白-羥基磷灰石復合材料修復兔骨缺損過程中對IL-1β和IL-18的基因表達，及NF-κB和NLRP3的蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購自中國碧云天生物技術研究所；離心機(Medifuge公司，意大利)；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；HA購自(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)；一抗(p-NF-κB p65,NF-κB p65,NLRP3,β-actin)購自Abcam公司；細胞總RNA提取試劑盒、一步法實時定量熒光聚合酶鏈反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2組織工程骨的制備:購買的桑蠶繭被用來產(chǎn)生絲綢溶液，桑蠶蠶繭在0.2 M Na2CO3中切割脫膠30min，然后在37℃干燥24h，將脫膠纖維溶解在9.3M溴化鋰溶液中，在60℃孵育4h，用12 kDa的膜用去離子水透析蛋白質(zhì)溶液72h，測定絲素濃度為3%(w/v)，在1×磷酸鹽緩沖液(PBS)中制備了3%w/v的鋁鈉溶液，將測定量的HA超聲分散在1×PBS的中孵育30min，制備的絲素和HA分散液的最終濃度分別為1%w/v和30%w/w。通過微尖噴嘴將制備的溶液逐滴(5mL/min)添加到0.2 M CaCl2溶液中，尖端在0.2 M CaCl2溶液上方3cm處，將復合材料老化12h以完成離子交換，并在37℃下干燥。

1.3動物模型和實驗分組:選擇新西蘭白兔16只(6周齡，雄性)，體重為2.0～2.2kg。全身麻醉，采用隨機數(shù)字法分為兩組，每組8只，分別為手術+HA組和手術+SF/HA組。手術方式為常規(guī)消毒兔右面頸部，沿右下頜骨下緣作弧形切口，逐層分離、暴露右側(cè)下頜骨，并于右側(cè)下頜骨中部截骨，同時去除右側(cè)下頜骨和骨膜，制造15mm長的右側(cè)下頜骨節(jié)段性骨缺損模型。兩組同時行右下頜骨下緣作弧行切口至去除右側(cè)下頜骨和骨膜，分別給予HA培養(yǎng)制備的組織工程骨和SF表面修飾的HA培養(yǎng)制備的組織工程骨。術后保溫至清醒，進行常規(guī)飼養(yǎng)48h。

1.4實時定量RT-PCR:術后48h取術區(qū)邊緣1cm處的骨組織，用TRIzol試劑(Invitrogen)從骨組織中分離總RNA，測定RNA的濃度和純度，測量了260nm處的吸光率和260/280nm的吸光率(Eppendorf，德國)。然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物進行PCR擴增，計算各組骨組織中RNA的相對表達量。見表1。

表1 實驗中所用到的引物

1.5免疫印跡法:用RIPA裂解液和PMSF溶解骨組織。用SDS-PAGE法從各組骨組織中分離出50～60μg總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉細胞膜，然后用抗p-NF-κB p65(1∶500；Abcam)、NF-κB p65(1∶1000；Abcam)、NLRP3(1∶500；Abcam)、β-actin(1∶1000；Abcam)的一抗孵育。用TBST洗滌后，用辣根過氧化物酶結合二抗(1∶5000)孵育膜，并用化學發(fā)光系統(tǒng)(ChampChemi；SAGECREATION，北京)觀察免疫印跡并拍照，灰度值圖像J(NIH，Bethesda，MD)統(tǒng)計。

2 結 果

2.1SF/HA對骨修復狀態(tài)下IL-1β和IL-18基因水平的影響:與手術+HA組相比，手術+SF/HA組IL-1β的mRNA水平明顯從4.56±0.26降低至2.09±0.12(P<0.05)；IL-18的mRNA水平明顯從5.08±0.08降低至2.20±0.21(P<0.05)(圖1)。

圖1 SF/HA對骨修復狀態(tài)下骨組織中IL-1β和IL-18基因水平的影響

2.2SF/HA對骨修復狀態(tài)下NF-κB和NLRP3蛋白水平的影響:與手術+HA組相比，手術+SF/HA組p-NF-κB的蛋白水平明顯從1.24±0.15降低至0.62±0.03(P<0.05)；NLRP3的蛋白水平明顯從1.15±0.04降低至0.61±0.05(P<0.05)(圖2)。

圖2 SF/HA對骨修復狀態(tài)下兔骨組織中NF-κB和NLRP3蛋白水平的影響

3 討 論

骨組織工程為修復骨缺損提供了合適的結構[9]。通過工程生物材料模擬自然組織的結構和組成，如開發(fā)無機-有機復合材料，在過去的幾十年里引起了人們的興趣和關注。生物活性玻璃、HA、檸檬酸鈣等典型陶瓷材料是骨組織工程的理想候選材料[10,11]。

SF與HA的共混促進了HA沿c軸方向的結晶，并對SF和HA的結構和性能產(chǎn)生了協(xié)同作用。HA的成核可以提高SF的分子取向和結晶度。同時，在SF中添加HA可以改善SF的生物學性能和力學性能，HA/SF復合材料與模擬自然骨組織無機和有機相的天然骨結構。因此，將無機和有機材料結合在一種獨特的混雜復合材料中可以提高骨組織支架的柔韌性、機械強度和韌性。

骨損傷引起急性炎癥反應，有益于骨修復，然而，如果急性炎癥反應被抑制、失調(diào)，或演變?yōu)槁匝装Y，可延緩或抑制骨損傷修復。關于SF與HA的共混對骨修復過程中慢性炎癥反應的作用，本研究結果表明，與應用HA培養(yǎng)制備的組織工程骨組比較，SF表面修飾的HA培養(yǎng)制備的組織工程骨明顯降低IL-1β和IL-18的mRNA水平，以及NF-κB和NLRP3的蛋白表達水平，本研究結果與藻酸鹽/HA/SF復合材料作為骨替代物的研究結果一致，植入藻酸鹽/HA/SF 4周后，與海藻酸鈉組相比較，海藻酸鈉/HA/SF支架組缺損部位的骨形成率明顯升高，同時海藻酸鈉/HA/SF支架具有良好的生物相容性，降解后的移植物周圍免疫原性反應減弱或形成巨細胞，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在海藻酸鈉/HA/SF組的表達水平明顯低于海藻酸鈉和海藻酸鈉/HA組。本研究證明了絲蛋白-羥基磷灰石復合材料通過可能通過抑制炎癥反應促進骨損傷修復，其機制可能是通過抑制NF-κB/NLRP3通路的激活，繼而減緩該通路介導的炎癥反應，具體機制待進一步研究，下一步的研究可著眼于絲蛋白-羥基磷灰石復合材料對骨損傷修復過程中焦亡、自噬、氧化應激等方面的影響，該研究結論提升了絲蛋白-羥基磷灰石復合材料在骨損傷修復中的臨床應用價值。