內(nèi)源性Relaxin-1 Relaxin-3及其受體LGR7表達(dá)水平在小鼠心房顫動(dòng)心肌纖維化中的作用

翁方中，胡朝梁，嚴(yán) 駿，戴 偉，周瑞祥

(湖北省武漢市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430022)

房顫是最常見的心律失常，一般人群房顫患病率可達(dá)0.4%～1.0%，且隨著年齡增長房顫患病率明顯增加，據(jù)報(bào)道年齡≥85歲以上人群房顫患病率可達(dá)17.4%。心肌纖維化則是心律失常的主要病理表現(xiàn)之一，且難以逆轉(zhuǎn)[1]。當(dāng)前臨床依據(jù)心肌纖維化的病理特征將其劃分為反應(yīng)性纖維化、或是修復(fù)性纖維化兩種，兩種心肌纖維化雖具不同的病理表現(xiàn)，但均可誘導(dǎo)心肌損傷，引起心臟重構(gòu)、心功能不全或心肌壞死。研究證實(shí)內(nèi)源性腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteron system,RAAS)、內(nèi)皮素(endothelin，ET)-一氧化氮(nitric oxide,NO)系統(tǒng)等心臟旁分泌系統(tǒng)或自分泌系統(tǒng)在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[2]；但關(guān)于內(nèi)源性抗心肌纖維化防御體系研究甚少，其作用尚不清楚，如松弛素(Relaxin,RLX)，作為迄今最強(qiáng)的內(nèi)源性抗纖維化物質(zhì)之一[3]，其抗心肌纖維化的機(jī)制也仍未闡明。鑒于此，本研究擬通過觀察內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3及松弛素受體(RLXreceptor,LGR7)的表達(dá)變化及Relaxin對心肌纖維化的影響，為探尋心肌纖維化發(fā)病的新機(jī)制和防治的新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57B62小鼠[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司《許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004》]40只，雄性，14周齡，體重25±3g；所有小鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，按12h間隔光照黑暗交替，溫度20～25℃，濕度40%～70%，自由飲食飲水，普通飼料。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則。

1.2房顫模型建立：40只C57B62小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為空白對照組、模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組，每組10只。模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組均構(gòu)建心房顫動(dòng)小鼠模型：腹腔注射ISO 2.5mg·kg-1·d-1，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水；連續(xù)注射2周后應(yīng)用MedLab-U/4C501H生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)描記小鼠心電圖，對照組為標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，建模大鼠則為標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心房顫動(dòng)，提示房顫模型建立成功；模型組+RLX1、模型組+RLX3組分別在造模成功后次日腹腔注射終濃度為100 ng/mL的RLX1、RLX3，連續(xù)注射7 d，空白對照組、模型組注射等量生理鹽水；一周后處死小鼠，取心臟組織備用。見圖1。

圖1 對照組小鼠與建模小鼠的Ⅱ?qū)?lián)心電圖

1.3組織標(biāo)本處理：20mg/kg 1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉；小鼠前胸開口，剪開左心耳，心間部穿刺后應(yīng)用20mL肝素鹽水灌注，待血液灌注干凈后取材；取4只小鼠僅保留左心室(每只小鼠左心室分3份)，液氮保存用于檢測Real-Time PCR檢測、Western Blot法；其余小鼠心臟組織制成4 μm厚的石蠟包埋切片(平行心臟縱軸連續(xù)切片)保存待檢。

1.4心肌膠原沉積纖維面積及心肌羥脯氨酸含量檢測：應(yīng)用天狼星紅染色觀察心肌纖維化，取石蠟切片常規(guī)脫蠟，苦味酸15s使背景變成紅色，1∶9比例的天狼猩紅:苦味酸滴染3min，無水乙醇10s、二甲苯3min，而后封片、鏡檢；采用Leica顯微鏡采集圖像，NIS-Elements 3.0分析圖像，Image-Pro plus 6.0軟件分別計(jì)算左心室、右心室、室間隔膠原沉積纖維面積百分比(膠原沉積纖維面積/整個(gè)心肌面積)。取20 mg液氮中心肌組織，應(yīng)用羥脯氨酸試劑盒檢測心肌羥脯氨酸含量，取30～100 mg左心室心肌組織，參照試劑盒說明書提取上清液，測定波長550時(shí)的吸光度(A)值，計(jì)算羥脯氨酸含量(μg/mg濕重)=(測定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5μg/mL)×水解液總體積(10mL)/組織濕重(mg)。

1.5心肌Relaxin 1、Relaxin3其受體LGR7表達(dá)：①Real-Time PCR法：依據(jù)TRIzol試劑盒說明書步驟提取小鼠左心室組織總RNA，分光光度劑測定RNA濃度及純度，參照TaKaTa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，應(yīng)用Real-Time PCR檢測心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參；應(yīng)用灰度掃描系統(tǒng)分析電泳條帶，半定量分析心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA水平(引物序列見表1)。②Western Blot法：提取心肌組織蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，按20μg/孔上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶室溫封膜后加入Relaxin 1抗體、β-actin抗體，40℃過夜。0.5% TBST洗膜、加二抗孵育60 min，洗膜后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法曝光拍照，Gel-pro 32圖像分析軟件定量分析結(jié)果，目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin的灰度比值為目的蛋白相對表達(dá)量。參照上述Real-Time PCR法、Western Blot法檢測Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白表達(dá)。

表1 引物序列表

1.6α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)的表達(dá)和組織分布：①免疫組化法：取組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，過氧化氫滅活過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后滴加α-SMA一抗，4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，而后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作也，雙花扁豆凝集素(DBA)顯色、封片；Image-Pro 5.1圖像分析軟見分析α-SMA表達(dá)，每張切片取5個(gè)連續(xù)陽性表達(dá)(鏡下可見棕褐色顆粒)視野，測定積分光密度(integral optical density,IOD)。②Western Blot法：參照1.5中Western Blot法步驟檢測心肌組織α-SMA蛋白表達(dá)，同樣以目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin的灰度比值為目的蛋白相對表達(dá)量，Western Blot法參照方法1.5。

1.7心肌纖維相關(guān)指標(biāo)表達(dá)：測定I型膠原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRNA及蛋白表達(dá)；Real-Time PCR、Western Blot檢測方法參照1.5。

1.8心肌血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ,AngⅡ)、醛固酮(Aldosterone,ALD)及其受體表達(dá)：Real-Time PCR法檢測心肌AngⅡ、血管緊張素受體1(angiotensin receptor 1,AT1)、血管緊張素受體2(angiotensin receptor 2,AT2R)、醛固酮(Aldosterone,ALD)、鹽皮質(zhì)激素受體MineralocorticoidReceptor，MR)mRNA表達(dá)，Real-Time PCR檢測方法參照1.5。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌膠原沉積纖維面積百分比、心肌羥脯氨酸含量比較：天狼猩紅染色可見心肌膠原纖維呈紅色，心肌細(xì)胞呈黃色表達(dá)，主要沉積于心肌細(xì)胞間隙、心肌血管周圍，空白對照組僅可見少量心肌膠原纖維沉積(圖A)，模型組可見大量心肌膠原纖維沉積(圖B)，模型組+RLX1、模型組+RLX3心肌膠原纖維沉積較模型組明顯減少(圖C、D)(見圖2)；模型組心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量較空白對照組顯著上升(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組室間隔、右心室及左心室心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3室間隔、右心室及左心室心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.016)，見圖2、表2。

圖2 天狼猩紅染色圖

表2 各組心肌膠原沉積纖維面積百分比心肌羥脯氨酸含量比較

2.2各組Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7比較：與空白對照組比較，模型組Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白則明顯上升(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.016)，見表3。

表3 各組Relaxin 1 Relaxin 3 LGR7比較

2.3各組α-SMA IOD、α-SMA蛋白比較：與空白對照組比較，模型組免疫組化圖陽性染色明顯增加(圖A、B)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3陽性染色明顯減少(圖C、D)；與空白對照組比較，模型組α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.016)，見圖3、表4。

圖3 α-SMA免疫組化圖

表4 各組α-SMA collagenⅠ collagenⅢ比較

2.4各組心肌MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1 mRNA比較：與空白對照組比較，模型組MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表達(dá)明顯上升，TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F<0.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表達(dá)明顯下降、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白明顯上升(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.016)，見表5。

表5 各組心肌MMP-1 MMP-2 MMP-9 MMP-13 TIMP-1比較

2.5各組大鼠Ang Ⅱ、ALD及其受體mRNA表達(dá)：與空白對照組比較，模型組Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明顯上升；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.016)，見表6。

表6 各組大鼠Ang Ⅱ ALD及其受體mRNA表達(dá)

3 討 論

心房顫動(dòng)的發(fā)病機(jī)制繁雜，心房重構(gòu)則是心房顫動(dòng)的重要病理環(huán)節(jié)之一，其最顯著特征為心肌纖維化，正常心肌細(xì)胞被膠原纖維包繞劃分，心肌細(xì)胞間的傳導(dǎo)連續(xù)性被破壞，增加傳導(dǎo)異質(zhì)性并減慢傳導(dǎo)速度，從而為折返環(huán)的形成及單項(xiàng)傳導(dǎo)阻滯提供病生理基礎(chǔ)[4,5]。當(dāng)前臨床抗心律失常藥物的主要作用機(jī)制仍是針對心房電重構(gòu)，治療效果有限。心肌纖維化作為心房顫動(dòng)的重要危險(xiǎn)因素，探討心房顫動(dòng)患者心肌纖維化分子機(jī)制有重要意義，可為心房顫動(dòng)的防治提供思路。Relaxin屬多功能活性多肽，是體內(nèi)分布極為廣泛，參與神經(jīng)垂體激素的分泌等廣泛生理過程的調(diào)節(jié)，與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，心血管疾病發(fā)病均有密切關(guān)聯(lián)，并具強(qiáng)大的抗纖維化效應(yīng)[6,7]。

本研究天狼猩紅染色可見心房顫動(dòng)小鼠心肌膠原纖維主要沉積于心肌細(xì)胞間隙、心肌血管周圍，存在明顯的心肌膠原纖維沉積，且心肌羥脯氨酸濕重明顯增加。由此可見，心房顫動(dòng)小鼠存在心肌纖維化，造模成功，且心房顫動(dòng)心肌纖維小鼠心肌內(nèi)源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表達(dá)明顯下調(diào)，存在表達(dá)缺失現(xiàn)象。為探究心房顫動(dòng)心肌纖維小鼠心肌內(nèi)源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表達(dá)對心肌纖維化的影響機(jī)制，本研究分別對模型小鼠補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3，結(jié)果顯示外源性補(bǔ)充RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 小鼠心肌膠原纖維沉積、心肌羥脯氨酸濕重增加現(xiàn)象明顯緩解；且在補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 小鼠Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白明顯上升。Kanai等[8]報(bào)道，Relaxin 1水平升高伴有心肌纖維化率降低，指出Relaxin 1可作為心室纖維化的生物標(biāo)志物，可能成為抗纖維化治療靶點(diǎn)。這與本研究結(jié)論相似，由此可見，Relaxin 1與心房顫動(dòng)小鼠心肌纖維化有關(guān)。

另肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化也與心肌纖維化密切相關(guān)，研究指出，當(dāng)心臟受炎性介質(zhì)、壓力超負(fù)荷等刺激時(shí)候多種細(xì)胞便可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，以α-SMA生成表達(dá)為特征性結(jié)構(gòu)表現(xiàn)及標(biāo)記[9]。而α-SMA又可通過抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解酶來促進(jìn)collagenⅠ、collagenⅢ分泌[10]。collagenⅠ、collagenⅢ作為心肌間質(zhì)膠原蛋白的主要成分，其含量及比值發(fā)生變化便可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積，最終引起間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)重建及心肌纖維化[11]。本研究顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠α-SMA水平明顯上升，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明顯增強(qiáng)；但在補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3后模型組+RLX1、模型組+RLX3 α-SMA表達(dá)較模型組明顯下降，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明顯減少。因此外源性補(bǔ)充RLX1、RLX3可下調(diào)心肌間質(zhì)膠原蛋白含量，或能達(dá)到抑制間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)重建、改善心肌纖維化的目的。MMPs、TIMPs則是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其直接參與心肌膠原合成與降解，是維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。本研究顯示，模型組MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上升、TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降；但補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3后模型組+RLX1、模型組+RLX3 MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)較模型組明顯下降、TIMP-1 mRNA及蛋白較模型組明顯上升。這也進(jìn)一步證實(shí)了外源性補(bǔ)充RLX1、RLX3在改善心肌纖維化上的價(jià)值。

研究指出[12]，心肌纖維化的發(fā)生與其自身的旁/自分泌活性物質(zhì)AngⅡ mRNA、ALD mRNA表達(dá)及活性增強(qiáng)關(guān)系密切。Relaxin則是心血管活性物質(zhì)，由心肌合成分泌，LGR7受體則主要富含于心室、心房，研究指出中樞系統(tǒng)Relaxin可通過抑制AngⅡ表達(dá)來調(diào)節(jié)中樞滲透壓[13]。本研究顯示模型組Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明顯上升，提示心肌纖維化小鼠心肌Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA存在明顯過表達(dá)現(xiàn)象，這與往期報(bào)道結(jié)論相似[14]。但補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA較模型組明顯下降。由此可見，Relaxin可能通過作用于心臟旁/自分泌的AngⅡ及ALD系統(tǒng)拮抗心肌纖維化，或可作為機(jī)體抗纖維化的內(nèi)源性防御體系。

綜上所述，由此可見，心房顫動(dòng)心肌纖維化小鼠內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3表達(dá)過低現(xiàn)象，補(bǔ)充外源性RLX1、RLX3可明顯改善其內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3表達(dá)過低現(xiàn)象，并有效改善心肌纖維化，分析Relaxin可能通過作用于AngⅡ及ALD系統(tǒng)拮抗心肌纖維化，值得臨床重視。