苗藥黑骨藤對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用研究

劉 耀，胡 蝶，徐 劍，郭 玲，程 純，張永萍

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫病[1]，目前，我國的發(fā)病率約為0.4%[2]，致殘率5年內(nèi)高達(dá)30%～50%[3]。由于該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，缺乏有效的根治及預(yù)防措施。臨床上多采用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、抗風(fēng)濕藥、生物制劑等藥物對其進(jìn)行非特異性對癥治療，存在著不良反應(yīng)多、費(fèi)用高等諸多缺點(diǎn)。

苗醫(yī)稱RA為“mongb hsongd jenl”(音譯：蒙沖靜)，屬于苗醫(yī)身架病癥中“鉆節(jié)風(fēng)”的范疇[4]，認(rèn)為其發(fā)病多與先天不足、氣候寒冷、久居濕地、勞累過度等因素有關(guān)[5]，早期多以寒濕痹阻痹證為基本證型[6]，苗醫(yī)藥在治療RA方面歷史悠久，具有獨(dú)特的治療優(yōu)勢。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)是貴州苗族治療風(fēng)濕與類風(fēng)濕疾病的常用藥物之一，具有通絡(luò)、活血、祛風(fēng)等功效[7]。研究表明，黑骨藤乙醇提取物對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)的增殖及環(huán)氧化酶-2(COX-2)、前列腺素2(PGE2)的表達(dá)水平具有明顯抑制作用[8]。黑骨藤多糖部位HGT-5A可抑制T細(xì)胞活化增殖，對細(xì)胞免疫反應(yīng)具有良好的抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)通過建立CIA大鼠模型，觀察黑骨藤乙醇提取物的治療作用，并探討其作用機(jī)制，以期為苗藥黑骨藤的深層次開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量150～180 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證編號：SCXK(湘)2014-0011，動物房環(huán)境：溫度18～26 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物與試劑

弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司，牛Ⅱ型膠原溶液購自美國Chondrex公司，大鼠IL-6、TNF-α檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，lgA、lgM、lgG檢測試劑盒購自Blue Gene公司，雷公藤多苷片購自貴州漢方制藥有限公司，黑骨藤藥材采自貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。

1.3 儀器與設(shè)備

LY70倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)，TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，MX-S渦旋儀(美國Scilogex公司)。

2 方法

2.1 供試品的制備

取黑骨藤藥材，加入80%的乙醇回流提取2次，固液比為10，每次1 h，合并提取液，濃縮揮干溶劑后，用蒸餾水配制成各給藥所需劑量的混懸液，既得。

2.2 分組及造模

將36只雌雄各半的SD大鼠隨機(jī)分為6組：A.正常組；B.雷公藤多苷陽性組；C.模型組；D.低劑量給藥組；E.中劑量給藥組；F.高劑量給藥組。除正常組外，其余各組采用膠原誘導(dǎo)的方法建立CIA大鼠模型。取牛Ⅱ型膠原溶液(濃度2 mg/mL)與等體積的弗氏不完全佐劑混合，制成濃度為1 mg/mL的膠原乳劑，大鼠尾根部皮內(nèi)注射膠原乳液0.2 mL，7天后加強(qiáng)免疫1次[10]。

2.3 給藥

免疫后第1天，按10 mL/kg進(jìn)行分組灌胃給藥，陽性組給予10 mg/kg雷公藤多苷，黑骨藤高、中、低劑量組給予濃度為2.1 g(生藥)/kg、1.05 g(生藥)/kg、0.525 g(生藥)/kg的黑骨藤醇提物混懸液，正常組與模型組灌胃同等劑量的生理鹽水，連續(xù)灌胃28天。

2.4 大鼠組腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)測定

將各組大鼠踝關(guān)節(jié)進(jìn)行標(biāo)記，每周采用排水法，測量其標(biāo)記處以下部位的排水體積，記錄各組大鼠足腫脹的變化程度，并采用5級評分法評價(jià)大鼠四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)[11]。

2.5 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病變情況

灌胃4周后，麻醉處死大鼠，取各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用4%的中性甲醛固定2天，置于EDTA溶液中脫鈣處理，選用不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水、采用石蠟進(jìn)行包埋、切片，進(jìn)行HE染色，觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理情況。

2.6 大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子及免疫球蛋白的測定

灌胃4周后，麻醉處死各組大鼠，取全血靜置20 min，以3 000 r/min離心15 min，采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6水平及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠AI評分比較

造模1周后，與正常組比較，模型組及各給藥組大鼠AI評分值均顯著升高(P<0.01)；灌胃治療2周后，與模型組比較，雷公藤多苷陽性組與黑骨藤各給藥組大鼠AI評分值均顯著降低(P<0.01)。雷公藤多苷陽性組與黑骨藤各給藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明其治療作用相當(dāng)；灌胃治療3周后，各給藥組大鼠AI評分值逐漸下降。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠AI評分結(jié)果

3.2 大鼠足腫脹度比較

造模1周后，與正常組比較，模型組及各給藥組大鼠足腫脹度均顯著增加(P<0.01)；造模2周后，模型組大鼠足腫脹度達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；灌胃治療2周后，黑骨藤高、中、低劑量組以及雷公藤多苷陽性組均能顯著抑制大鼠足腫脹(P<0.01)；灌胃治療3周后，黑骨藤高劑量組與正常組足腫脹度相當(dāng)(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠足腫脹度變化

3.3 大鼠血清中細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

灌胃治療4周后，模型組大鼠IL-6和TNF-α表達(dá)水平較正常組顯著上升(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，雷公藤多苷陽性組、黑骨藤給藥組可顯著抑制CIA大鼠血清中IL-6和TNF-α表達(dá)水平(P<0.01)；其中黑骨藤高劑量組與雷公藤多苷陽性組在IL-6表達(dá)上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明黑骨藤高劑量組與雷公藤多苷陽性組下調(diào)IL-6作用相當(dāng)。黑骨藤高、中劑量組較雷公藤多苷陽性組在TNF-α表達(dá)上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)，且黑骨藤高、中劑量組下調(diào)TNF-α作用優(yōu)于陽性組。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6，TNF-α含量水平

3.4 大鼠血清中免疫球蛋白lgA、lgM、lgG表達(dá)水平比較

灌胃治療4周后，與模型組比較，雷公藤多苷陽性組與黑骨藤高、中劑量組血清中l(wèi)gM含量顯著降低(P<0.05)。雷公藤多苷陽性組與黑骨藤給藥組血清中l(wèi)gA、lgG含量顯著降低(P<0.05)；雷公藤多苷陽性組與黑骨藤高、中劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明黑骨藤高、中劑量組與雷公藤多苷陽性組治療作用相當(dāng)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清lgA、lgM、lgG含量水平

3.5 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病變情況

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織表面光滑，滑膜細(xì)胞排列整齊無增生，未見炎癥細(xì)胞浸潤及血管增生。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，滑膜表面呈現(xiàn)粗糙感，層次較為紊亂，滑膜細(xì)胞及血管增生，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，形成血管翳，軟骨退變。與模型組比較，雷公藤多苷陽性組及黑骨藤各給藥劑量組軟骨退變、骨破壞、滑膜細(xì)胞及血管增生明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤情況明顯減少，其病理狀況得到顯著改善。

A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.黑骨藤低劑量組；E.黑骨藤中劑量組；F.黑骨藤高劑量組

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種病因復(fù)雜、機(jī)制尚不明確的自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞及血管增生、軟骨退變及骨破壞等。RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇，中醫(yī)藥以辨證論治為主，具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用。雷公藤、青風(fēng)藤、馬錢子等中藥已被廣泛應(yīng)用于RA的治療，其中中藥有效成分雷公藤多苷對RA具有良好的治療作用，作用機(jī)制明確，已開發(fā)成中藥新藥并在臨床上廣泛使用，故本實(shí)驗(yàn)選擇雷公藤多苷片為陽性藥物進(jìn)行研究。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的病理特征及發(fā)病過程與RA類似，為關(guān)節(jié)滑膜組織增生、關(guān)節(jié)軟骨退變及骨侵蝕破壞[12]，是國際公認(rèn)研究RA的理想動物模型，因此本研究選用CIA大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠AI評分值及其足腫脹程度均明顯升高，血清中細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG的表達(dá)水平均顯著升高，同時觀察其足踝關(guān)節(jié)組織，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜細(xì)胞增生，及血管翳形成，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功。

TNF-α作為多效的細(xì)胞因子，主要由活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可通過激活內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，以及促進(jìn)其他細(xì)胞因子和趨化因子的擴(kuò)增參與各種炎癥反應(yīng)，同時也可抑制成骨細(xì)胞的分化和功能，進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，在RA的發(fā)病機(jī)制中展示出了多種相關(guān)效應(yīng)功能。IL-6作為RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，由活化巨噬細(xì)胞及成纖維滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，與TNF-α有相似作用，可使免疫系統(tǒng)細(xì)胞、皮內(nèi)細(xì)胞、破骨細(xì)胞活化，產(chǎn)生急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雷公藤多苷陽性組及黑骨藤給藥組血清中IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低，黑骨藤高劑量組與雷公藤多苷陽性組下調(diào)IL-6作用相當(dāng)，且黑骨藤高、中劑量組下調(diào)TNF-α作用優(yōu)于陽性組。

RA作為一種自身免疫疾病，其病情的發(fā)展與機(jī)體自身免疫功能紊亂密切相關(guān)[14]。致病因子會誘導(dǎo)體內(nèi)Th細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子，并激活B細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗體，抗原與抗體結(jié)合生產(chǎn)免疫復(fù)合物，導(dǎo)致出現(xiàn)免疫反應(yīng)，引發(fā)組織受損，其表達(dá)水平的升高可引起一系列免疫反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雷公藤多苷陽性組與黑骨藤高、中劑量給藥組血清中l(wèi)gA、laM、lgG含量明顯降低；黑骨藤高、中劑量給藥組與雷公藤多苷陽性組治療作用相當(dāng)。

綜上所述，本研究構(gòu)建CIA大鼠模型，采用灌胃黑骨藤80%乙醇提取物的方式進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果顯示黑骨藤可緩解關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善軟骨退變及骨破壞，其作用機(jī)制可能與其下調(diào)細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α及免疫球蛋白lgA、lgM、lgG的表達(dá)水平有關(guān)。本研究還提示黑骨藤與雷公藤具有相近的抗RA作用，但其抗RA藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)都尚待進(jìn)一步探索。