唐梔子提取物對腦出血大鼠認知及運動功能的影響

遲 棟，陳永祥

(1.南陽醫(yī)學高等?？茖W校，河南 南陽473000；2.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州450008)

唐梔子環(huán)烯醚萜苷是從河南省唐河縣特產(chǎn)唐梔子中提取出的有效成分，包括山梔子苷、異梔子苷、去羥梔子苷等。研究[1-2]證實，梔子環(huán)烯醚萜苷可抑制腦出血后腦損傷，減輕腦水腫癥狀，降低腦出血病死率，但其治療腦出血的具體機制尚未闡明。本研究通過建立腦出血大鼠模型，觀察唐梔子環(huán)烯醚萜苷對腦出血大鼠認知及運動功能的影響，并分析其可能的作用機制，為進一步研究提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只健康SPF級雄性SD大鼠，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：0001507。在室溫22～24 ℃，相對濕度45%～55%環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水，12 h交替光照，處理方法遵守動物倫理原則。

1.2 藥品與主要儀器

唐梔子環(huán)烯醚萜苷購自西安佰斯特生物科技有限公司，含量98%(HPLC法)，批號：20190311；Ⅳ型膠原酶(Sigma)；鼠抗Caspase-3、Bax、Bcl-2單克隆抗體(Novus)；鼠抗GADPH單克隆抗體(LSBio)；辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(上海一基生物有限公司)；垂直電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀(UVP)。

1.3 分組與建模

60只SD雄性大鼠通過雙盲法分為假手術(shù)組、模型組、唐梔子環(huán)烯醚萜苷低、中、高劑量組，每組12只。采用Ⅳ型膠原酶制備腦出血大鼠模型[3-5]，術(shù)前大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥(300 mg·kg-1)，將大鼠麻醉后固定。常規(guī)皮膚消毒并將前鹵充分暴露，采用牙科鉆在中線右3 cm處磨取1 mm骨窗，微型注射器進針5 mm注入0.1 mLⅣ型膠原酶(0.3 U·μL-1)，1 min內(nèi)注射完畢。留針5 min，退針至硬腦膜后留針2 min，之后完全退針，并縫合切口。大鼠蘇醒后須單籠飼養(yǎng)。模型組與唐梔子環(huán)烯醚萜苷低、中、高劑量組通過上述方法建模，假手術(shù)組同上述操作但不注射Ⅳ型膠原酶。術(shù)后參考Longa評分法[6]篩選動物模型，無神經(jīng)功能缺損記為0分；前爪無法完全伸展，表現(xiàn)出輕度神經(jīng)功能缺損記為1分；行走時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，表現(xiàn)出中度神經(jīng)缺損記為2分；行走時向癱瘓側(cè)傾倒，表現(xiàn)出重度神經(jīng)功能缺損記為3分；無法行走，喪失意識記為4分。評分1～3分表示建模成功，剔除建模失敗與死亡大鼠，最終各組均保留10只大鼠進行后續(xù)實驗。

1.4 給藥治療

建模1 d后，唐梔子環(huán)烯醚萜苷低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射7.5、15、30 mg·kg-1劑量的唐梔子環(huán)烯醚萜苷，假手術(shù)組與對照組則注射等量生理鹽水，連續(xù)治療1周。治療期間通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠認知功能變化，通過平衡木行走實驗觀察大鼠運動功能變化。治療1周后，將大鼠麻醉取出腦組織檢測腦組織含水量，采用Western blot法檢測病灶組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平。

1.5 Morris水迷宮實驗

準備內(nèi)徑約160 cm的Morris水迷宮圓形池，水池內(nèi)水深30 cm，水溫23～25 ℃，水池內(nèi)壁涂黑，將其劃分為面積相同的4個象限，并隨機選取任一象限設(shè)置水下隱蔽平臺(水面下1 cm)。給藥1 d后各組大鼠進行定位巡航實驗，將大鼠面向池壁從隨機象限入水點放入池中，記錄大鼠找到水下隱蔽平臺并站立(停留至少3 s)所需時間(逃避潛伏期)。若大鼠入水后2 min內(nèi)未能找到隱藏平臺，則用長棍將大鼠誘導至平臺，令其在平臺上站立30 s，此時，逃避潛伏期記為2 min。連續(xù)測量5 d，第6天將水下隱蔽平臺撤除，進行空間探索實驗，記錄2 min內(nèi)大鼠穿越平臺位置的次數(shù)。

1.6 平衡木行走實驗

準備一長80 cm，寬2.5 cm的平衡木，放置于距水平面10 cm處，將大鼠放置于平衡木上，根據(jù)大鼠表現(xiàn)記錄評分。大鼠在平衡木上站穩(wěn)持續(xù)2 min記為1分；大鼠在平衡木上站立并左右搖晃但未跌落持續(xù)2 min記為2分；大鼠在平衡木站立時間超過30 s但不足2 min即跌落記為3分；大鼠在平衡木站立不足30 s即跌落記為4分；大鼠無法站立，立即從平衡木跌落記為5分。

1.7 腦組織含水量檢測

麻醉處死大鼠后將其腦組織分離，剝?nèi)バ∧X、腦干、嗅球等部分后稱取濕重(W)，稱重后放入恒溫干烤箱內(nèi)，110 ℃烘烤24 h后稱取干重(D)，腦含水量=(W-D)/W×100%。

1.8 Western blot法蛋白表達水平檢測

取適量病灶組織研磨制備成勻漿，加入蛋白抽提試劑置于冰上裂解30 min。離心取上清液，調(diào)整蛋白濃度后加入Buffer變性后上樣進行電泳。孵育、轉(zhuǎn)膜、顯色、成像并進行結(jié)果分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認知功能比較

各組大鼠逃避潛伏期均表現(xiàn)出隨時間變化而不斷縮短的趨勢，模型組大鼠3 d起逃避潛伏期均明顯長于假手術(shù)組(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(P<0.05)，提示腦出血會影響大鼠的認知功能。與模型組比較，唐梔子環(huán)烯醚萜苷中、高劑量組大鼠3 d起逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯增多(P<0.05)，提示唐梔子環(huán)烯醚萜苷可改善腦出血大鼠認知功能。見表1、表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較

表 2 各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較

2.2 各組大鼠運動功能比較

模型組大鼠平衡木行走實驗評分持續(xù)升高，2 d起明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，提示腦出血會影響大鼠的運動功能。唐梔子環(huán)烯醚萜苷各劑量組大鼠平衡木行走實驗評分持續(xù)升高，在3 d達到峰值并逐漸下降，3 d起唐梔子環(huán)烯醚萜苷中、高劑量組大鼠平衡木行走實驗評分均明顯低于模型組(P<0.05)，提示唐梔子環(huán)烯醚萜苷可改善腦出血大鼠運動功能。見表3。

表3 組大鼠平衡木行走實驗評分比較

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，唐梔子環(huán)烯醚萜苷各劑量組大鼠腦組織含水量明顯下降(P<0.05)，提示唐梔子環(huán)烯醚萜苷可有效改善腦出血腦水腫癥狀。見表4。

表4 各組大鼠腦組織含水量比較

2.4 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，唐梔子環(huán)烯醚萜苷各劑量組Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，Bcl-2表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討論

腦出血發(fā)生時病灶部位由于炎性浸潤會產(chǎn)生大量炎性因子、氧自由基等毒性代謝產(chǎn)物，從而損害神經(jīng)元細胞并誘導細胞發(fā)生凋亡[7]。細胞凋亡是不同于程序性死亡的另一種形式，主要受相關(guān)基因調(diào)控[8]。Caspase家族介導并執(zhí)行細胞凋亡，Caspase-3則參與細胞凋亡通路的核心環(huán)節(jié)。

注：A假手術(shù)組；B模型組；C唐梔子環(huán)烯醚萜苷低劑量組；D唐梔子環(huán)烯醚萜苷中劑量組；E唐梔子環(huán)烯醚萜苷高劑量組

Caspase-3被激活后可對不同底物進行切割并促使細胞核固縮，導致神經(jīng)元DNA發(fā)生斷裂并抑制細胞增殖[9]。Caspase-3蛋白表達水平上調(diào)不僅表示細胞凋亡加劇，也是出血性腦損傷的重要標志[10]。在哺乳動物細胞凋亡過程中，Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制因子與Bax、Bak等促凋亡因子也起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[11]。Bcl-2可調(diào)控線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔道復合體阻止促凋亡蛋白釋放，從而抑制細胞凋亡進程。Bax受到凋亡信號刺激被激活后會發(fā)生磷酸化進入線粒體內(nèi)，并與Bcl-2形成二聚體形成Bax大孔通道，與Bcl-2等蛋白發(fā)生對抗，發(fā)揮促凋亡作用[12]。故觀察病灶組織Caspase-3、Bax、Bcl-2表達水平，即可直接反映腦出血大鼠細胞凋亡程度。

涂鄂文等[13]設(shè)計了腦出血大鼠實驗觀察槲皮素對大鼠神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以增加Bcl-2/Bax蛋白比值，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕大鼠神經(jīng)損傷，槲皮素可提高病灶組織過氧化物歧化酶活性并降低丙二醛含量，從而減少氧自由基誘導的細胞凋亡過程。潘冬梅等[14]采用黃芪甲苷對高血壓腦出血大鼠實施干預，發(fā)現(xiàn)其可減輕高血壓腦出血大鼠氧化應激反應，改善大鼠神經(jīng)行為學缺陷。郭輝等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷能保護腦出血大鼠神經(jīng)功能并減輕大鼠腦水腫程度，認為其機制在于抑制細胞凋亡。可見，抑制神經(jīng)細胞凋亡是保護腦出血大鼠神經(jīng)功能，減輕腦損傷的重要機制。

環(huán)烯醚萜苷是梔子藥材中的有效化學成分，具有清熱抗炎等藥理作用，梔子苷(京尼平苷)是其中的代表成分[16]。動物學研究[17]表明，給予大鼠60 mg·kg-1京尼平苷灌胃，在腎臟中檢出最高濃度，其次為肝、脾、腦。而且京尼平苷入腦后主要分布在神經(jīng)遞質(zhì)較為豐富的海馬部位[18]，為環(huán)烯醚萜苷治療各類腦損傷疾病奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)代藥理研究證實，梔子在神經(jīng)保護、抗炎、抗氧化應激等方面均有一定的活性。曹靜等[19]發(fā)現(xiàn)，梔子苷可以提高大鼠在Y迷宮中的學習與記憶能力。步楠等[20]發(fā)現(xiàn)，梔子苷可有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠疾病癥狀并抑制炎性因子表達水平。因此，猜測環(huán)烯醚萜苷治療腦出血大鼠也會有一定效果，故設(shè)計動物學實驗探究其可能的作用機制。結(jié)果表明，腦出血發(fā)生后大鼠腦組織含水量增加，且認知及運動功能均明顯下降，Caspase-3、Bax蛋白表達水平上調(diào)，Bcl-2表達水平明顯降低提示細胞凋亡加劇。給予大鼠唐梔子環(huán)烯醚萜苷干預后，大鼠Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯下降，Bcl-2表達水平明顯升高，大鼠認知及運動功能明顯改善，腦水腫程度明顯下降，說明唐梔子環(huán)烯醚萜苷可有效緩解腦出血疾病癥狀，其可能的機制在于調(diào)控凋亡基因并抑制細胞凋亡。

綜上，唐梔子環(huán)烯醚萜苷可通過下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白并提升Bcl-2蛋白表達抑制細胞凋亡進程，從而對腦出血大鼠認知及運動功能起到保護作用。