油茶燙傷膏對(duì)燙傷的療效研究

陳玲霞，周子涵，宋 濤，謝 璐，陳水親，劉志平，3

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2015級(jí)生物技術(shù)本科生；3. 贛南醫(yī)學(xué)院炎癥與免疫中心，江西 贛州 341000）

燙傷是最常見(jiàn)的皮膚損傷之一，在低收入國(guó)家燙傷致死率尤其高。它是臨床常見(jiàn)熱力燒傷的一種，是因熱力、熾熱金屬、火焰、蒸氣和高溫氣體等所致的體表組織損害，主要是皮膚損害，以中小面積Ⅱ度燙傷為主［1］。臨床表現(xiàn)主要為紅、腫、熱、痛，損傷主要發(fā)生在皮膚、黏膜，治療效果主要與病變范圍和深度有關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái)，沒(méi)有找到較為理想的治療藥物和方法，始終難以解決患者的疼痛、感染、結(jié)痂、留疤、植皮、致殘等問(wèn)題［2］。因此，尋找新的有效且不良反應(yīng)小的藥物或輔助用藥成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。

油茶（Camellia oleifera）為我國(guó)特有的油料樹(shù)種且資源豐富。茶油作為食用油無(wú)不良反應(yīng)，被稱(chēng)為“東方的橄欖油”［3］，另外，茶油也一直用來(lái)治療皮膚燒燙傷及紅腫、發(fā)熱、瘙癢等［4］。油茶籽經(jīng)過(guò)壓榨可獲得茶枯餅，而茶枯餅提取物（Camellia cake extracts，CCEs）具有較高的應(yīng)用價(jià)值。有研究表明茶枯餅中含量最豐富的化合物是茶皂素和多酚類(lèi)化合物［5-6］，茶皂素又具有抗炎抑菌、抗氧化性、抗腫瘤、降血脂、美白等功效［7-10］。來(lái)源于茶枯餅的油茶皂苷具有保護(hù)心肌、抗腫瘤等作用［11-13］，在抗炎方面可能通過(guò)降低血清和血管壁細(xì)胞黏附分子（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)來(lái)抑制燙傷導(dǎo)致的炎癥［14］，YE Y 等研究發(fā)現(xiàn)油茶皂苷可能通過(guò)抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而控制小鼠皮膚炎癥［15］。最近，我們的研究發(fā)現(xiàn)CCEs 具有通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和促進(jìn)膠原蛋白的合成治療小鼠燙傷，并且CCEs 對(duì)人體沒(méi)有毒性［16］。這些研究提示CCEs 有抗皮膚炎癥的作用，本文利用CCEs為原材料制備不同濃度的燙傷膏，研究其對(duì)小鼠燙傷創(chuàng)面的治療作用，以期找到對(duì)燙傷創(chuàng)面愈合最佳的純天然燙傷膏。

1 材料和方法

1.1 小鼠的來(lái)源C57BL/6 小鼠購(gòu)于南京模式動(dòng)物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 燙傷膏處方組成CCEs 由贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李洪亮課題組提供，CCEs 的來(lái)源及分析已在之前發(fā)表論文中詳細(xì)描述［16］。我們將CCEs 的干粉溶解在30%甲醇中，并稀釋至合適的濃度。使用Agilent 1290 UHPLC 串 聯(lián)6230 ESI-TOF MS 系 統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國(guó)）進(jìn)行CCEs提取混合物的分析，其代表性成分包括山茶苷A和B等。我們利用CCEs為原材料制備了5種燙傷膏（表1），具體成分如下：

表1 燙傷膏的種類(lèi)及其配比

油脂型：凡士林（8009-03-8，西安天正藥輔有限公司）40 g，蜂蠟（B9340，Solarbio）18 g，液體石蠟（8012-95-1，西安天正藥輔有限公司）42 g，CCEs 50 mg。

水溶型：CCEs 1 g或2 g，PEG400（P8530，Solarbio）30.3 g，PEG4000（P8240，Solarbio）60.5 g，丙 二 醇（P7071，Solarbio）5 g，焦亞硫酸鈉（CB04927309，成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司）0.2 g，蒸餾水2 g，約制成100 g軟膏。

O/W 型：硬脂酸（SS8520，Solarbio）6 g，硬脂醇（8005-44-5，西安天正藥輔有限公司）6 g，凡士林6 g，液體石蠟9 g，司盤(pán)80（1338-43-8，陜西正一藥用輔料有限公司）1.6 g，吐溫80（9005-65-6，陜西正一藥用輔料有限公司）4.4 g，甘油（G8190，Solarbio）10 g，羥苯乙酯（120-47-8，陜西正一藥用輔料有限公司）0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，蒸餾水加至100 g。

W/O型：?jiǎn)斡仓岣视王ィ?0233-64-8，陜西正一藥用輔料有限公司）12 g，蜂蠟5 g，凡士林5 g，液體石蠟30 g，司盤(pán)80 2 g，吐溫80 1 g，羥苯乙酯0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，加蒸餾水至100 g。

1.2.2 燙傷模型的制備及分組取C57BL/6小鼠，體重18～20 g，用10%硫化鈉脫毛，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、燙傷不處理組、燙傷后燙傷膏處理組、燙傷后尿素軟膏處理組。將小鼠放在控制板上，俯臥位顯示30%體表總面積。隨后，用1.5 cm 空心塑料管垂直放置在小鼠的背部。一端與皮膚接觸、從另一端倒入2 mL 100 ℃水浸泡25 s。造成深Ⅱ度燙傷（經(jīng)病理切片證實(shí)）。

分組給藥，燙傷后的小鼠單籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面每2天換藥1 次，共14 d。生理鹽水沖洗后，各組外敷相應(yīng)的燙傷膏，給藥部位用無(wú)菌紗布縫扎固定。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 創(chuàng)面愈合率燙傷后第14 d 用透明硫酸紙描記創(chuàng)面，以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙板剪成同樣大小，然后用電子天平稱(chēng)定重量，以重量代替面積，計(jì)算創(chuàng)傷愈合率。創(chuàng)傷愈合率=（原始燙傷面積－各時(shí)間點(diǎn)未愈合面積）/原始燙傷面積。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察燙傷后14 d 切取創(chuàng)面外緣皮膚，經(jīng)福爾馬林固定后，石蠟切片，進(jìn)行HE 染色及膠原蛋白染色（索萊寶Masson 三色染色試劑盒）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8 軟件。所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 燙傷膏的選擇為了選擇最佳燙傷膏，我們對(duì)已經(jīng)構(gòu)建好的燙傷模型進(jìn)行藥物治療。共8 組，空白對(duì)照、燙傷不處理組、燙傷后尿素軟膏處理組和燙傷后5種自制燙傷膏處理組。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示燙傷不處理小鼠在第14 d 燙傷皮膚處開(kāi)始出現(xiàn)增生肉芽組織，而尿素軟膏、1#燙傷膏和2#燙傷膏治療效果較好（圖1）。后期我們選擇1#燙傷膏和2#燙傷膏進(jìn)行藥膏治療效果的評(píng)估。

圖1 燙傷膏的治療效果

2.2 各組創(chuàng)面愈合率的比較為了進(jìn)一步研究1#和2#燙傷膏對(duì)燙傷的治療效果，我們對(duì)燙傷不處理組、燙傷后尿素軟膏處理組、燙傷后1#燙傷膏處理組和燙傷后2#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示與燙傷不處理組相比，1#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率是0.91（F=5.3，P=0.009）；尿素軟膏涂抹組的創(chuàng)面愈合率是0.87（F=5.3，P=0.039），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率（0.74）比燙傷不處理組（0.68）高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。由于2#燙傷膏治療燙傷的效果不顯著，我們選擇1#燙傷膏進(jìn)行下一步研究。

圖2 各組創(chuàng)傷愈合率比較

2.3 各組燙傷部位病理學(xué)觀察為了研究油茶燙傷膏對(duì)小鼠燙傷的治療作用機(jī)制，我們對(duì)小鼠燙傷部位分別使用1#燙傷膏、尿素軟膏進(jìn)行涂抹，對(duì)照小鼠含空白對(duì)照組和燙傷不處理組，第14 d 收集燙傷皮膚組織進(jìn)行HE 染色和膠原蛋白染色。結(jié)果顯示空白對(duì)照組各層結(jié)構(gòu)完整，表皮層扁平整齊，毛囊和皮脂腺分布均勻；真皮中的膠原纖維束呈螺旋狀，束間縱向排列整齊；真皮層組織及附屬結(jié)構(gòu)清晰可辨，細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)；燙傷不處理組小鼠皮膚燙傷創(chuàng)面可見(jiàn)許多脫落的表皮細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形壞死，表皮層凹凸不平有縱向溝痕，真皮層與表皮界限不明，真皮層多數(shù)顯空洞，細(xì)胞無(wú)序排列，膠原纖維束少且薄，排列無(wú)序，有些顯斷裂或點(diǎn)狀；尿素軟膏組小鼠皮膚表皮仍可見(jiàn)空隙或裂痕狀，真皮層增厚，與燙傷不處理組相比，細(xì)胞形態(tài)要明顯好轉(zhuǎn)，真皮內(nèi)膠原纖維束增厚，且排列整齊；1#燙傷膏組小鼠皮膚真皮層與表皮界限分明，毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)良好，膠原纖維束增厚明顯，恢復(fù)接近正常水平（圖3）。

圖3 各組燙傷部位病理組織學(xué)觀察

3 討 論

燙傷在人群中的發(fā)病率約0.2%，且兒童患者超過(guò)1/3，損傷輕微則治愈率較高，但若損傷嚴(yán)重死亡率較高［17］。因此，如何有效地提高燒燙傷患者的創(chuàng)面愈合并降低死亡率仍是我們急需解決的問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型燙傷膏的治療效果比較，初期選擇出燙傷愈合效果最好的水溶型軟膏1#和2#用于后期的治療效果檢測(cè)，而水溶型軟膏1#和2#的治愈效果良好可能跟燙傷膏的類(lèi)型有關(guān)。油脂型燙傷膏中CCEs 溶解不充分且釋藥慢；W/O 或O/W 型乳膏劑不適用于有大量組織液滲出的創(chuàng)面，使用時(shí)會(huì)導(dǎo)致分泌物重新透入皮膚而使得創(chuàng)口惡化［18］。燒燙傷常導(dǎo)致皮膚屏障被破壞，大量組織液滲出、出血、創(chuàng)面糜爛［19］，而水溶型燙傷膏釋藥快且易洗除，能夠吸收組織分泌液，非常適用于燒燙傷的治療，但對(duì)皮膚的潤(rùn)滑、軟化作用較差，后期可對(duì)該燙傷膏添加防腐劑和保濕劑進(jìn)行優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物燒燙傷模型相關(guān)的研究報(bào)道較多，如豬［20］、兔［21］、大鼠［22］、小鼠［23］的燙傷模型研究，建模所用的對(duì)象和方法多樣，尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的燙傷動(dòng)物模型。目前采用的熱水燙傷、蒸汽燙傷等方法常導(dǎo)致皮膚創(chuàng)面邊緣不齊，燙傷面積和深度不易控制，重復(fù)性差［24］。本文采取熱水燙傷建立了深Ⅱ燙傷模型，通過(guò)吸管引流，改善燙傷產(chǎn)生的一致性，減少組間差異，重復(fù)性較好。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)創(chuàng)傷愈合率的計(jì)算、燙傷部位HE 染色和膠原蛋白染色，評(píng)估自制燙傷膏對(duì)燙傷創(chuàng)面的治療效果。燙傷不處理組小鼠表現(xiàn)為皮膚組織出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形壞死、膠原蛋白減少且嚴(yán)重被破壞等，而自制燙傷膏和尿素軟膏的使用減輕了這些損傷。膠原蛋白是皮膚的主要組成成份，對(duì)皮膚損傷的恢復(fù)至關(guān)重要［25-26］，自制燙傷膏的使用逆轉(zhuǎn)了膠原蛋白的減少，提示皮膚從損傷中恢復(fù)。而且燙傷膏的使用，促使了膠原蛋白的增生，與空白對(duì)照組相比，膠原纖維束更厚，可能是燙傷膏促使皮膚恢復(fù)的原因。燙傷膏可以促使膠原蛋白增生，可能是茶枯餅提取物的作用效果，但茶枯餅提取物的成分多，具體治療燙傷的分子尚待研究。有研究表明茶枯餅提取物具有美白功效［27］，后期可用于美容產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與利用。

燙傷后愈合過(guò)程，主要包括急性期炎性反應(yīng)和組織修復(fù)細(xì)胞的作用［28］，它涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、燙傷創(chuàng)面收縮、瘢痕形成及組織重塑等［29］。從皮膚組織病理學(xué)、膠原蛋白的形態(tài)和創(chuàng)面愈合率來(lái)看，自制燙傷膏不僅能有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面病理組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且能有效地促進(jìn)創(chuàng)面組織中膠原蛋白的合成和增加，促進(jìn)創(chuàng)面組織的修復(fù)。燙傷膏改善創(chuàng)面愈合和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用，可能與抑制炎性細(xì)胞因子、增加皮膚相關(guān)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的作用機(jī)制有關(guān)［30-31］。無(wú)論是抑制炎癥、抑制細(xì)菌感染或者促進(jìn)愈合修復(fù)等都還需更深入的研究，以開(kāi)發(fā)出真正的純天然燙傷膏用于皮膚損傷。