重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對小鼠缺血性腦卒中急性期小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控作用

方瑩瑩，張靖慧

（1. 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 廣東省康復(fù)醫(yī)學(xué)會；3. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510630）

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是由多種因素導(dǎo)致腦血流量降低所引起的腦血管疾病。根據(jù)其病程可分為急性期（＜2 周）、恢復(fù)期（2 周～6 個(gè)月）、后遺癥期（＞6 個(gè)月）。如對處于急性期的缺血性腦卒中患者進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)治療，其預(yù)后良好［1-2］。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（Repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）屬于一種無痛、無創(chuàng)的康復(fù)治療技術(shù)，其通過磁脈沖信號作用于單側(cè)特定皮質(zhì)部位，磁刺激信號連續(xù)不斷的穿透顱骨對腦功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，改善腦功能［3-5］。小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，分布于灰質(zhì)和白質(zhì)中，約占腦細(xì)胞總數(shù)的10%［6］。MG 未激活時(shí)保持靜息狀態(tài)，不具有吞噬能力，但具有一定程度的遷移和吞飲能力，可監(jiān)察腦實(shí)質(zhì)內(nèi)微環(huán)境的狀態(tài)，及時(shí)清除壞死的神經(jīng)元，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的平衡。當(dāng)大腦出現(xiàn)炎癥、感染和創(chuàng)傷時(shí)，MG 被激活呈現(xiàn)其吞噬功能，在一些腦部疾病中，MG 不僅能發(fā)揮其吞噬功能，也可促進(jìn)相關(guān)組織恢復(fù)、神經(jīng)再生［7］。目前相關(guān)研究顯示rTMS 不僅用于IS 的功能評估和預(yù)測預(yù)后，還可促進(jìn)IS腦功能恢復(fù)［8］，但其作用機(jī)理有待繼續(xù)深究。本研究將rTMS 作用于急性期缺血性腦卒中模型小鼠，探究rTMS對小膠質(zhì)細(xì)胞極化作用的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑線栓（豫順生物，型號：0622），TTC（Sigma，No：T8877），Trizol 試劑（Takara，#9109），cDNA 合成試劑盒（Takara，#6130），rTMS 治療儀（武漢依瑞德公司CCY-Ⅰ型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF 級健康雄性C57BL/6小鼠80 只，體重20～22 g［動(dòng)物合格證號：SCXK（粵）2016-0041］。本研究方案經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究委員會批準(zhǔn)。動(dòng)物可隨意獲取食物和水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（22±1）℃，將小鼠飼養(yǎng)在12 h 光—暗循環(huán)下，并允許在手術(shù)后自由獲取食物和水。采用隨機(jī)分組的方法將小鼠分為4 組：假手術(shù)組、MCAO 對照組、rTMS 干預(yù)組及假刺激組，每組20只。

1.3 小鼠大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）模型制作［9-10］C57BL/6 小鼠，異氟烷誘導(dǎo)麻醉，待完全失去知覺后，仰臥固定于手術(shù)臺上。頸部正中剪開皮膚，分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈上的2 個(gè)小動(dòng)脈分支用電烙鐵燙斷凝固。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用5-0 手術(shù)線打死結(jié)，拉緊結(jié)扎，近心端用4-0 手術(shù)線打死結(jié)，中間用5-0 手術(shù)線打活結(jié)，頸總動(dòng)脈用4-0 手術(shù)線打活結(jié)。然后插入線栓，勒緊5-0 手術(shù)線以固定線栓，然后剪開近心端處的4-0 手術(shù)線，繼續(xù)插入線栓至頸外頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處。剪斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，拉住斷端使線栓掉頭，然后順勢插入線栓，感到有阻力后停。小鼠缺血1.5 h，缺血期間放入恒溫恒濕箱，待缺血完畢后，拔出線栓，縫合皮膚。

1.4 rTMS 刺激假手術(shù)組和MCAO 對照組小鼠不做任何處理，自然飼養(yǎng)。rTMS 干預(yù)組小鼠頭部固定于MagLite 磁刺激儀上的動(dòng)物線圈，線圈直徑12 mm，頭皮緊貼線圈，中心位于小鼠右耳前3 mm。設(shè)置磁刺激頻率為10 Hz，強(qiáng)度為70%最大輸出強(qiáng)度，拔栓1 h 后開始刺激，連續(xù)刺激20 次為1 組，每天2 組，連續(xù)刺激5 d。假刺激組同干預(yù)組實(shí)驗(yàn)條件一致，但磁刺激儀不通電。

1.5 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)術(shù)前1 d 及術(shù)后3 d、5 d 進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。將小鼠放在加速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒上（5 min 內(nèi)從4 r·min-1加速到40 r·min-1），直到小鼠掉落，記錄停留時(shí)間，5 min 內(nèi)仍未掉下按5 min 計(jì)算。每只小鼠每日進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)間隔20 min。

1.6 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色麻醉小鼠取腦，放入0.1 M PBS的冰水混合物中，2 min后大腦變硬，取出放入腦槽，以1 mm間距切片，然后放入2%TTC染液中（0.1 M PBS配制），室溫，正反面各染5 min，然后放入4%甲醛溶液中固定，6 h后拍照。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測使用Trizol 試劑從半暗帶腦組織中提取總RNA。RNA 定量后，使用cDNA 合成試劑盒將RNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用7500 Real-Time PCR 系統(tǒng)，根據(jù)試劑盒說明書，使用Bestar SybrGreen qPCR-masterMix（DBI，USA）檢測目的基因的表達(dá)水平。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算方法來計(jì)算結(jié)果。引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，計(jì)量資料以±s 表示，小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測量方差檢驗(yàn)，qPCR 實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rTMS 刺激減少腦梗死灶及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)腦組織TTC 染色結(jié)果（圖1A）顯示，假手術(shù)組未見腦梗灶，而MCAO 對照組與假刺激組梗死灶明顯，rTMS刺激明顯減小梗死灶。同時(shí)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1B）顯示，rTMS 刺激組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上待的時(shí)間長于MCAO 對照組及假刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 rTMS刺激減少腦梗死灶及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)

2.2 rTMS 刺激抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，促進(jìn)M2極化RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，MCAO 對照組iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平高于假手術(shù)組，Arg1、Ym1 表達(dá)水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-10 表達(dá)水平與假手術(shù)組無明顯差異；MCAO 對照組和假刺激組在各項(xiàng)指標(biāo)上無明顯差異；rTMS 干預(yù)組的iNOS、TNF-α、IL-1β 表達(dá)水平低于MACO 對照組，而IL-10、Arg1、Ym1表達(dá)水平高于MCAO 對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-6 表達(dá)水平與MCAO 對照組無明顯差異。見圖2。

圖2 rTMS刺激促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化

3 討 論

腦卒中因其高致死、高致殘、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅公眾健康的重大疾病，其中缺血性腦卒中占87%［11-12］。此前對缺血性腦卒中的研究主要集中在血管阻塞、氧化應(yīng)激對于血管的損傷及腦組織缺氧缺血導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡，對于機(jī)體自身的相關(guān)免疫反應(yīng)研究尚不充分。正常機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MG 處于靜息態(tài)，當(dāng)機(jī)體腦部組織受到炎癥、缺血等外界因素刺激時(shí)，靜息態(tài)MG 迅速被激活，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆樱彝淌晒δ芎瓦w移作用增強(qiáng)。根據(jù)MG 發(fā)揮的作用不同，可分為M1 型和M2 型。M1 型是促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生的細(xì)胞，具有明顯的神經(jīng)毒性作用，M2 型又分為M2a、M2b、M2c 3 種亞型，是促進(jìn)血管生成及炎癥修復(fù)的細(xì)胞。正常狀態(tài)下，M1 和M2 處于動(dòng)態(tài)平衡，一旦機(jī)體受到外界因素刺激或病理狀態(tài)下，平衡將會被打破，同時(shí)M1型MG 將會在相關(guān)因子的作用下向M2 型極化，在炎癥后期發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)損傷修復(fù)［13-14］。

rTMS因其無痛、無創(chuàng)、無損的特點(diǎn)，在腦部疾病的治療上具有極大的優(yōu)勢［15］。有研究證明rTMS 干預(yù)能夠促進(jìn)IS 的恢復(fù)，不僅可以興奮運(yùn)動(dòng)皮層，還可刺激神經(jīng)再生［16］。目前認(rèn)為rTMS 的作用機(jī)制與突觸可塑性相關(guān)，且rTMS與神經(jīng)的調(diào)控和頻率具有極大的相關(guān)性。高頻rTMS（＞1 Hz）對神經(jīng)興奮性的調(diào)控表現(xiàn)類似長時(shí)程增強(qiáng)（Long-temm potentiation，LTP）作用，因而本次研究我們使用高頻rTMS進(jìn)行研究。

本研究光鏡的觀察結(jié)果顯示rTMS 干預(yù)組海馬組織病理情況優(yōu)于MCAO 對照組和假刺激組。iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子是M1 型MG 的功能性標(biāo)記物，其中iNOS是促進(jìn)谷氨酸和NO分泌的酶，谷氨酸和NO 分泌過多會加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境失衡，最終致使神經(jīng)元變性、壞死。而IL-10、Arg1、Ym1是M2型MG的功能標(biāo)記物，是M2型MG 分泌的神經(jīng)保護(hù)因子。我們對iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg1 及Ym1 等炎癥相關(guān)因子進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示MCAO對照組iNOS2、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組；MACO 對照組和假刺激組的iNOS2、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平顯著高于rTMS 干預(yù)組，而IL-10、Arg1、Ym1 表達(dá)水平顯著低于rTMS干預(yù)組。提示rTMS干預(yù)對于M1 型向M2 型MG 的極化有促進(jìn)作用，可降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IS帶來的炎癥恢復(fù)。

綜上所述，rTMS作用于急性期缺血性腦卒中可恢復(fù)相關(guān)梗死區(qū)域的功能，其作用機(jī)制可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1 的極化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2 的極化，降低炎癥反應(yīng)。