抗體技術(shù)的研發(fā)現(xiàn)狀與展望

武瑞君，桑曉冬，李治非，敖 翼，范 玲

（中國生物技術(shù)發(fā)展中心，北京 100039）

抗體類生物治療藥物因其具有靶向性強、特異性好、治療效果顯著等優(yōu)點，在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位［1］。近年來，抗體藥物獲批數(shù)量顯著增加，市場占有率節(jié)節(jié)攀升，成為生物藥中增長最快的領(lǐng)域。隨著抗體藥物的需求不斷加大，抗體技術(shù)的發(fā)展也日新月異，從多克隆抗體制備到單克隆抗體篩選，取得了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體到全人源抗體等一系列突破性的成果，抗體技術(shù)成為生物技術(shù)領(lǐng)域特別是生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點。抗體藥物隨著抗體技術(shù)的不斷創(chuàng)新而發(fā)現(xiàn)，同時技術(shù)創(chuàng)新又加速了新的抗體藥物的研發(fā)速度和生產(chǎn)水平的提升［2-4］。不斷創(chuàng)新抗體技術(shù)等關(guān)鍵核心技術(shù)，將變革性新技術(shù)應(yīng)用于抗體等藥物的研發(fā)，對推動我國抗體藥物自主研發(fā)乃至新藥創(chuàng)制具有重要意義。本文介紹抗體技術(shù)發(fā)展歷程，系統(tǒng)綜述雜交瘤單克隆技術(shù)、抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等最新技術(shù)，對抗體新技術(shù)研發(fā)的重要性進行分析，并對未來發(fā)展予以展望。

1 發(fā)展歷程

伴隨著抗體的發(fā)現(xiàn)和對抗體認(rèn)識的不斷加深，抗體技術(shù)的研究正在不斷拓展。廣義的抗體技術(shù)包括抗體的生產(chǎn)及與應(yīng)用相關(guān)的所有技術(shù)，狹義的抗體技術(shù)則是指與抗體生產(chǎn)相關(guān)的技術(shù)。根據(jù)發(fā)展歷程，抗體技術(shù)可分為多克隆抗體技術(shù)、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)3個階段。

1.1 多克隆抗體技術(shù)

多克隆抗體發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)末。1890年，德國科學(xué)家Behring和日本科學(xué)家Shibasaburo發(fā)現(xiàn)，用白喉毒素免疫動物獲得的免疫血清中有一種能夠中和白喉毒素的物質(zhì)存在，這種白喉毒素的抗血清即為一種多克隆抗體［5］。多克隆抗體的制備多通過免疫動物獲得，當(dāng)抗原注射到動物體內(nèi)后就會產(chǎn)生針對該抗原的抗體。大多數(shù)抗原表面成分復(fù)雜，具有多種不同的抗原表位，因而免疫血清中產(chǎn)生的抗體為針對多種抗原成分或抗原表位的、綜合的、不均一的多克隆抗體［2］。目前，恢復(fù)期患者血漿療法用于急性病毒性傳染病的應(yīng)急治療仍受到廣泛關(guān)注，如在流感、埃博拉、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）流行期間均使用患者恢復(fù)期血漿療法進行治療或臨床研究［6］。

1.2 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代。1975年，英國科學(xué)家Kohler和Milstein將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞融合［7］，成功建立了雜交瘤單克隆抗體技術(shù)，成為第二代抗體生產(chǎn)技術(shù)。體外培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體但不能長期存活，而腫瘤細(xì)胞可以無限繁殖，將二者融合，融合后的子代細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又能夠無限傳代，從而獲得抗體純度高、理化性質(zhì)均一、特異性強的單克隆抗體［3］。

1.3 基因工程抗體技術(shù)

基因工程抗體出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代早期。1984年，Morrison等［8］首次報道了人鼠嵌合抗體?；蚬こ炭贵w亦稱為重組抗體，是指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)等對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達的抗體分子。利用基因工程抗體技術(shù)減少抗體鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成為第三代抗體技術(shù)［4］。目前常見的技術(shù)包括鼠源抗體人源化技術(shù)，以及抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等人源抗體篩選技術(shù)。

2 最新研究進展和應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合抗體藥物的生物學(xué)特性，研發(fā)人員在傳統(tǒng)抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化創(chuàng)新，力求通過更簡便快速的方法，獲得免疫原性更低、人體相容性更好及成本更低的治療性抗體。

2.1 雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來，將免疫動物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成在體外長期存活并分泌免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞，通過克隆化得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的雜交瘤單克隆細(xì)胞系，生產(chǎn)大量單克隆抗體（圖1）。此過程中，雜交瘤細(xì)胞2次篩選至關(guān)重要［9］。最傳統(tǒng)的二次雜交瘤篩選方法為有限稀釋法［9］。該方法操作簡單，不需要特殊設(shè)備，但人工操作速度慢、效率低、耗時長、易出錯，不能滿足高通量篩選的要求。流式分選技術(shù)也較多用于雜交瘤細(xì)胞的篩選，在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記熒光信號，通過熒光信號強度反映細(xì)胞的抗體表達水平，并將收集高熒光信號強度的細(xì)胞，再通過有限稀釋或單細(xì)胞收集器得到高水平表達的單克隆［10］。該方法具有自動化速度快和精確度較高等優(yōu)點，但需要對細(xì)胞進行熒光標(biāo)記，且檢測結(jié)果易受細(xì)胞周期影響。

圖1 雜交瘤技術(shù)聯(lián)合鼠源抗體人源化技術(shù)路線示意圖.PEG HAT：聚乙二醇次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)液.

隨著技術(shù)進步，目前一種新的雜交瘤篩選技術(shù)——全自動細(xì)胞篩選系統(tǒng)（Cellcelector）得到廣泛使用。該方法使用半固體培養(yǎng)，使細(xì)胞生長成單個獨立、分散、無法移動的單克隆，加入熒光標(biāo)記克隆檢測試劑并捕獲目標(biāo)抗體后，在細(xì)胞克隆中形成熒光暈狀物質(zhì)。通過比較克隆細(xì)胞與克隆細(xì)胞周圍暈直徑的大小，計算出產(chǎn)生抗體的比例，即質(zhì)量系數(shù)。用機械臂及挑頭自動化挑取質(zhì)量系數(shù)最高的細(xì)胞克隆獲得最高的抗體生產(chǎn)克?。?1-12］。作為最新一代技術(shù)，該全自動細(xì)胞篩選系統(tǒng)具有高通量，自動化，高效率，可編程、量化和存檔及追溯等優(yōu)點，可縮短研發(fā)周期，降低成本。

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)方便、簡單、成本低，但僅能用于鼠源抗體篩選。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的第一個抗體藥物莫羅單抗（muromomab-CD3）即為用雜交瘤技術(shù)篩選的鼠源抗體，但鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識別，引起強烈的人抗鼠抗體反應(yīng)，使得藥物療效減弱，并引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，利用雜交瘤技術(shù)直接獲得的鼠源抗體藥物在臨床應(yīng)用上受到極大限制，除少數(shù)化療用鼠源抗體仍在臨床使用外，鼠源抗體基本已被淘汰。為解決這一問題，科學(xué)家利用基因工程方法對鼠源抗體進行人源化，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)。直至1994年，美國FDA才批準(zhǔn)了第二個抗體藥物即人鼠嵌合抗體藥物阿昔單抗（abciximab）上市。此后，通過雜交瘤技術(shù)篩選得到抗體通常需要進一步進行人源化改造，才能作為抗體藥物進入臨床應(yīng)用。

2.2 抗體文庫展示技術(shù)

抗體文庫展示技術(shù)是近30多年快速發(fā)展起來的一項技術(shù)，已成為抗體工程的前導(dǎo)工具。由于不能直接用雜交瘤技術(shù)獲得人源抗體，所以抗體文庫展示技術(shù)主要用來篩選人源抗體。利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從B細(xì)胞中擴增出抗體的重鏈和輕鏈群，將它們連入合適的載體表達隨機的聯(lián)合抗體文庫（圖2）。按抗體基因來源，目前抗體庫主要有天然抗體庫、半合成抗體庫、全合成抗體庫和混合抗體庫等類型。同時，隨著計算機輔助分析和虛擬設(shè)計的發(fā)展，還發(fā)展出表位特異性的靶向抗體庫技術(shù)平臺。根據(jù)抗體文庫所用載體的不同，目前主要的技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)等［13］。

圖2 抗體文庫展示技術(shù)路線示意圖（噬菌體展示文庫為例）.

噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)為噬菌體侵蝕細(xì)菌并利用細(xì)菌表達自身外殼蛋白等過程。1985年，Smith等［14］第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。該方法純化步驟簡單，不要求昂貴的試劑和設(shè)備，但是存在肽庫容量只能達到1×109、系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因表達等缺點，且噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，一定程度上限制了文庫中分子遺傳多樣性［15］。2002年，美國FDA批準(zhǔn)上市的首個全人源抗體藥物阿達木單抗（adalimumab）就是利用噬菌體展示文庫篩選得到的。同時，具有結(jié)構(gòu)簡單、相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強、易于重組改造、組織穿透力強等優(yōu)點的納米抗體，也通常是利用免疫羊駝聯(lián)合噬菌體展示文庫技術(shù)篩選而來，如2018年9月美國FDA批準(zhǔn)上市的目前唯一一個納米抗體藥物卡普賽珠單抗（caplacizumab），即是利用該技術(shù)研發(fā)得到。

酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一項真核蛋白展示技術(shù)。1997年，Boder和Wittrup等［16］將抗熒光素蛋白的單鏈可變區(qū)與α凝集素結(jié)合亞基的N端融合，首次建立了酵母展示系統(tǒng)。作為真核表達系統(tǒng)，酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)可以對蛋白進行翻譯后修飾，且真核分泌系統(tǒng)有“質(zhì)量”控制機制，能阻止錯誤折疊的蛋白被輸運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外，可使用流式細(xì)胞術(shù)對已構(gòu)建的酵母細(xì)胞庫進行定量和實時篩選，高效便捷［13］。2020年，美國FDA批準(zhǔn)在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表達得到的抗體藥物依普奈珠單抗（eptinezumab）上市，使其成為首個酵母表達的抗體藥物。目前該技術(shù)也被用于納米抗體的開發(fā)。

此外，核糖體展示技術(shù)［17］和mRNA展示技術(shù)［18］作為新興的克隆展示技術(shù)，完全在體外進行。通過構(gòu)建DNA文庫，在體外進行轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終形成“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”（核糖體展示技術(shù)）或“cDNA-mRNA-蛋白質(zhì)”（mRNA展示技術(shù)）三聚體，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白質(zhì)）聯(lián)系起來，最后從中分離mRNA或cDNA進行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增。該類技術(shù)與噬菌體或酵母細(xì)胞展示技術(shù)相比，具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強、篩選方法簡便、可通過引入突變和重組技術(shù)提高靶標(biāo)蛋白親和力等優(yōu)點。同時，mRNA展示技術(shù)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA/mRNA雜交雙鏈，還避免了RNA二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)對體外篩選的干擾［19］。目前，越來越多的研究人員將該類技術(shù)應(yīng)用于新藥開發(fā)等領(lǐng)域。如二磷酸腺苷核糖基化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛存在于多種病毒、細(xì)菌和真核生命體內(nèi)，在調(diào)節(jié)炎癥信號通路中發(fā)揮重要作用。然而，該種修飾在細(xì)胞內(nèi)豐度相對較低，并處于單體修飾和多聚體修飾2種形式的動態(tài)變化中，缺乏商用的特異性抗體，限制了研究人員對其進行大規(guī)模研究。蘇黎世大學(xué)Micheal團隊使用核糖體展示技術(shù)和定向進化策略，獲取了一種突變體eAfr1521，并將其應(yīng)用于二磷酸腺苷核糖基化修飾的研究，為后續(xù)研發(fā)提供了新的工具和策略［20］。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

1985年，科學(xué)家首次提出將人源抗體基因?qū)胄∈笊臣?xì)胞，通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)人源抗體的建議，該想法的提出開創(chuàng)了人源抗體生產(chǎn)研發(fā)的新思路［21］。1989年，Brüggemann等［22］首次構(gòu)建了人源抗體重鏈基因載體，將人IgG基因座轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，引起基因重排并表達IgM。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)是應(yīng)用基因工程技術(shù)破壞小鼠內(nèi)源抗體基因，然后將人抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，再使用目標(biāo)抗原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在其體內(nèi)表達相應(yīng)抗體的技術(shù)（圖3）。該技術(shù)使抗原抗體免疫反應(yīng)在小鼠體內(nèi)進行，保證了抗體類別轉(zhuǎn)換的完整性、抗體克隆選擇的多樣性及抗體親和力成熟的自然機制，因此利用該技術(shù)得到的抗體具有良好的親和性、穩(wěn)定性和可溶性等。由于該技術(shù)體系難度較大，具有技術(shù)壁壘高的特點，僅有少數(shù)公司掌握，主要有XenoMouse，UltiMab，VelociImmune和Kymab等轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)路線示意圖.

XenoMouse小鼠、UltiMab小鼠、VelociImmune小鼠和Kymab小鼠分別是美國Cell Genesys公司、Medarex公司和再生元（Regeneron）公司及英國Kymab公司研究人員培育而成。XenoMouse小鼠與UltiMab小鼠作為第一代轉(zhuǎn)基因小鼠，技術(shù)類似，均轉(zhuǎn)入了人IgH和Igκ的主要基因，同時小鼠自身的IgH和Igκ失活。VelociImmune小鼠和Kymab小鼠類似，將小鼠的IgH和Igκ的V區(qū)精確地替換為對應(yīng)的人IgH和Igκ的V區(qū)，同時保留了小鼠自身所有C區(qū)和其他基因表達調(diào)控原件。利用上述4種轉(zhuǎn)基因小鼠均有獲得美國FDA批準(zhǔn)上市的抗體藥物，其中美國Medarex公司利用UltiMab小鼠研發(fā)的抗體藥物獲批最多，達10個，如2009年獲批的4個抗體藥物卡那單抗（canakinumab）、優(yōu)特克單抗（ustekinumab）、戈利木單抗（golimumab）和奧法木單抗（ofatumumab）及2014年獲批程序性死亡受體1抗體納武單抗（nivolumab）。美國再生元公司利用轉(zhuǎn)基因小鼠開發(fā)埃博拉病毒中和抗體。2020年，美國FDA批準(zhǔn)的首個埃博拉抗體療法因馬澤布（inmazeb）即利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)研發(fā)。COVID-19疫情期間，美國再生元公司也利用該轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)開展了新型冠狀病毒中和抗體的研發(fā)工作。

目前，我國研究團隊也在積極建立轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)研發(fā)體系。和鉑醫(yī)藥公司培育了Harbour小鼠，擁有H2L2和HCAb 2個品系。H2L2小鼠能產(chǎn)生具有2條全人源重鏈和輕鏈的單克隆抗體，HCAb小鼠能產(chǎn)生獨特的具有全人源可變區(qū)片段的重鏈抗體。重慶市畜牧科學(xué)院培育了CAMouse小鼠，擁有全人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouseHG和全人單域抗體轉(zhuǎn)基因小鼠CAMouseH2個品系。

2.4 單細(xì)胞測序技術(shù)

單細(xì)胞測序技術(shù)即單個B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)，是近年來新發(fā)展的一類快速制備單克隆抗體的技術(shù)，是根據(jù)每個B細(xì)胞只含有1個功能性重鏈可變區(qū)DNA序列和1個輕鏈可變區(qū)DNA序列，以及每個B細(xì)胞只產(chǎn)生1種特異性抗體的特性，將單細(xì)胞分離鑒定技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)形成的一種全人源單克隆抗體的體外表達系統(tǒng)（圖4）。利用該技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有全人源性、高度抗原特異性、親和性高和基因多樣性豐富等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療、病原微生物感染治療、自身免疫疾病檢測和治療及人類免疫系統(tǒng)研究等各個領(lǐng)域［23］。單細(xì)胞測序技術(shù)主要包括單個B細(xì)胞分選，抗體基因擴增和克隆及抗原特異性抗體表達、篩選和鑒定等過程。如何分選得到單個B細(xì)胞是單細(xì)胞測序技術(shù)最重要的挑戰(zhàn)之一。相對傳統(tǒng)的B細(xì)胞分選策略是通過溶血空斑技術(shù)［24］、顯微操作法、磁珠分選法［25］、流式分選法［26］和激光切割法等技術(shù)，將單個細(xì)胞分離捕獲至容器，具有精確和節(jié)省細(xì)胞等優(yōu)點，但單個細(xì)胞操作成本較高。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)飛速發(fā)展和細(xì)胞分選技術(shù)的不斷優(yōu)化和改進，目前有以下幾種較成熟的技術(shù)或平臺。

圖4 單細(xì)胞測序技術(shù)路線示意圖.

單液滴微流控技術(shù)（Drop-seq）是一種通過微流控裝置，將細(xì)胞和帶有條碼、分子標(biāo)簽的引物微珠一起裝入微小的液滴中，其中條碼用于標(biāo)記細(xì)胞，分子標(biāo)簽用于標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本，每個液滴作為逆轉(zhuǎn)錄和PCR的微小反應(yīng)室，含有1個細(xì)胞和1個微珠。同1個細(xì)胞的mRNA被標(biāo)記上相同的條碼，因此可以通過條碼區(qū)分不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。目前常用的商業(yè)化單細(xì)胞測序平臺10×Genomics就是基于該技術(shù)衍生而來，利用“雙十字”微流體交叉系統(tǒng)，橫向孔道逐個導(dǎo)入凝膠微珠，第一個縱向道輸入細(xì)胞，凝膠微珠和細(xì)胞碰撞被吸附在微珠上，然后通過微流控技術(shù)運送到第二個縱向的“油管”通道，形成一個個油滴凝膠微珠。每一個凝膠微珠都布滿了不同的條碼和分子標(biāo)簽連接的序列，細(xì)胞裂解后進行轉(zhuǎn)錄、測序。該方法具有操作簡便、耗時短、成本低、通量高等優(yōu)點，建庫僅需約12 h，7 min內(nèi)可完成100～80 000個細(xì)胞的捕獲［26］。

單孔板測序技術(shù)（Microwell-seq）是基于微孔板和帶有條碼的引物，對大量的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)錄組分析的方法。該技術(shù)與Drop-seq不同之處在于把微液滴換成了微孔，將細(xì)胞懸液和帶有條碼的引物微珠鋪在微孔板的微孔中，使每個微孔含有1個細(xì)胞和1個微珠，細(xì)胞裂解后，細(xì)胞中的mRNA被微珠捕獲，這樣同1個細(xì)胞中的mRNA都帶有相同的條碼標(biāo)記，然后混在一起進行轉(zhuǎn)錄和測序［27］。

Beacon單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)是美國Berkeley Lights公司開發(fā)的一款能夠快速進行單細(xì)胞分析的細(xì)胞分選和成像系統(tǒng)，通過整合微流控的納升級微反應(yīng)器技術(shù)、光電定位技術(shù)以及計算機系統(tǒng)等，實現(xiàn)單細(xì)胞分選、培養(yǎng)、檢測和收集的自動化和一體化。其中基于Beacon系統(tǒng)的抗體早期發(fā)現(xiàn)流程可以概括為免疫和抗體分泌細(xì)胞富集、抗體分泌細(xì)胞鋪板、抗性克隆鑒定、陽性克隆挑選及抗體序列獲取、克隆和表達等5個環(huán)節(jié)。該技術(shù)對常規(guī)方法進行了系統(tǒng)革新，大大縮短了研發(fā)周期，提高了研發(fā)效率［28］。

單細(xì)胞測序技術(shù)可以實現(xiàn)高通量篩選和測序，目前在抗體藥物篩選領(lǐng)域應(yīng)用日趨廣泛，由于該技術(shù)近10年才高速發(fā)展，暫無獲批上市的藥物，但有多個利用該技術(shù)研發(fā)的藥物正處于臨床試驗階段，如擬用于治療巨細(xì)胞感染的司韋單抗（sevirumab）和治療癌癥的普林木單抗（pritumumab）等。其中，由美國渤?。˙iogen）生物技術(shù)公司研發(fā)的阿杜卡尼單抗（aducanumab）備受關(guān)注，該單抗是一種靶向寡聚β淀粉樣蛋白、用于治療阿爾茨海默病的研究性藥物。研究人員對比了來自無認(rèn)知障礙健康老年受試者和具有緩慢認(rèn)知衰退的老年受試者的B細(xì)胞文庫，利用單細(xì)胞測序技術(shù)開發(fā)了人源重組單克隆抗體阿杜卡尼單抗。研究結(jié)果顯示，接受阿杜卡尼單抗治療的患者在認(rèn)知和功能指標(biāo)如記憶、定向和語言方面獲益顯著，個人理財、做家務(wù)（如清潔、購物和洗衣）以及獨立外出旅行等日常生活活動也有獲益［29］。該公司于2020年7月向FDA提交了阿杜卡尼單抗生物制品許可申請，美國FDA于2020年8月受理，并授予了優(yōu)先審查，目前正在同時接受歐盟和日本監(jiān)管機構(gòu)的審查。COVID-19疫情期間，單細(xì)胞測序技術(shù)成為研發(fā)新冠病毒中和抗體的主流技術(shù)，美國禮來（Eli Lilly）公司聯(lián)合加拿大AbCellera Biologics公司、韓國國立保健研究院等團隊，以及中國科學(xué)院微生物研究所、清華大學(xué)和北京大學(xué)等多個中國團隊開展相關(guān)研究，其中LY-CoV555（美國禮來公司團隊研發(fā)）和JS016（中國科學(xué)院微生物研究所團隊研發(fā)）組成的中和抗體聯(lián)合療法于2021年2月9日獲批美國FDA緊急使用授權(quán)［30-33］。

3 不同抗體技術(shù)優(yōu)勢和劣勢對比

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)、抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)作為4種常用的抗體技術(shù)，各自具有不同的優(yōu)勢和劣勢（表1）。

表1 4種主要抗體技術(shù)優(yōu)勢和劣勢對比

雜交瘤單克隆抗體技術(shù)成熟、方便、成本低，但是僅能用于鼠源抗體篩選，且鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識別，引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此利用雜交瘤技術(shù)篩選得到抗體通常需要進一步進行人源化改造。

與雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相比，抗體文庫展示技術(shù)省去了細(xì)胞融合的步驟，擴大了篩選容量，可以直接得到人源化抗體基因，且抗體文庫展示技術(shù)正在快速發(fā)展，不斷衍生出體內(nèi)、體外、真核等不同的表達系統(tǒng)，為篩選鑒定特異性抗體提供了更多方便的平臺。但目前抗體文庫展示技術(shù)仍不能廣泛用于完整IgG抗體的展示，需要首先片斷化展示后重建完整抗體分子，易篩選到非特異性的結(jié)合或親和力低下的抗體，且抗體庫難以儲存和運輸，是相關(guān)科研材料共享的一大阻礙。在美國FDA已批準(zhǔn)上市的抗體藥物中，利用該技術(shù)篩選的僅占約10%。如何克服以上問題將是未來該技術(shù)發(fā)展的重要方向。

盡管首個全人源抗體來自噬菌體展示技術(shù)，但轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)仍是目前全人源抗體藥物領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的主流技術(shù)，具有高效、快速和對人體蛋白具有較好的免疫原性等優(yōu)點。利用該技術(shù)產(chǎn)生的抗體整體上成功率更高，已研發(fā)出治療銀屑病、黑色素瘤和高膽固醇血癥等多種疾病的全人源單克隆抗體。截至2019年11月，美國FDA批準(zhǔn)的30個全人源抗體藥物中，有21個來自轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，占比70%。但由于人和小鼠之間免疫系統(tǒng)組成存在差異，如何通過轉(zhuǎn)基因小鼠獲得更接近人體天然產(chǎn)生的抗體結(jié)構(gòu)，仍然是未來研究的主攻方向。

單細(xì)胞測序技術(shù)具有快速、高通量、不受轉(zhuǎn)化效率的限制等優(yōu)點，可直接從B細(xì)胞篩選全人源性、高特異性、高親和性的抗體，且隨著一些先進儀器用于單細(xì)胞測序平臺，該技術(shù)已成為篩選病毒類抗原抗體的主流技術(shù)。目前該技術(shù)還未完全發(fā)展成熟，且抗體來源受限于B細(xì)胞，較難獲取靶向自身抗原的抗體，但未來仍有很大的開發(fā)空間和應(yīng)用前景。

4 分析和展望

抗體藥物以其獨特的優(yōu)勢，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染類疾病的診斷和治療中發(fā)揮著越來越重要的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。2021年2月11日，美國FDA批準(zhǔn)再生元公司研發(fā)的血管生成素樣蛋白3抗體依維蘇單抗（evinacumab）上市，作為全新作用機制的降脂藥，用于患有純合子家族性高膽固醇血癥的≥12歲兒童和成人患者，商品名為Evkeeza。依維蘇單抗的獲批標(biāo)志著美國FDA批準(zhǔn)的抗體藥物達到100個。伴隨著不同學(xué)科的匯聚和深度融合、分子生物學(xué)技術(shù)和重組抗體技術(shù)的不斷完善和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，抗體技術(shù)在不斷進步和革新，抗體藥物也不斷朝著免疫原性更低、人體相容性更好、成本更低等方向發(fā)展。因此，加強可轉(zhuǎn)化底層技術(shù)的基礎(chǔ)研究，不斷創(chuàng)新抗體技術(shù)等關(guān)鍵核心技術(shù)，提升創(chuàng)新藥物研發(fā)技術(shù)平臺能力建設(shè)，不斷將變革性新技術(shù)應(yīng)用于抗體等藥物的研發(fā)，對推動我國抗體藥物自主研發(fā)乃至新藥創(chuàng)制具有重要意義。

4.1 加強基礎(chǔ)研究，提高源頭創(chuàng)新能力

目前我國進入臨床研究的創(chuàng)新藥物多為國外已知靶點和先導(dǎo)化合物的跟蹤性創(chuàng)新藥物，基礎(chǔ)研究薄弱是我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展長期受制于人的根本原因之一。因此，包括抗體藥物研發(fā)在內(nèi)的新藥研發(fā)要主動對接科技前沿新突破，持續(xù)加強新靶點的發(fā)現(xiàn)與驗證、藥物作用的新機制等基礎(chǔ)研究，提高我國新藥創(chuàng)制的基礎(chǔ)研究水平，逐步掌握創(chuàng)新引領(lǐng)的主動權(quán)，從模仿創(chuàng)新轉(zhuǎn)變?yōu)樵谀承┓较蛏蠈崿F(xiàn)原始創(chuàng)新，全面提高源頭創(chuàng)新能力。

4.2 加強制約發(fā)展的關(guān)鍵核心技術(shù)突破，全面提升核心競爭力

關(guān)鍵核心技術(shù)對優(yōu)化新藥創(chuàng)制體系、促進制藥產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級以及實現(xiàn)自主可控具有至關(guān)重要的戰(zhàn)略意義?？贵w藥物研發(fā)經(jīng)歷了多克隆抗體技術(shù)、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)到現(xiàn)在的單細(xì)胞測序技術(shù)等一系列技術(shù)迭代，顯著提高了藥物研發(fā)效率。因此，要圍繞制約抗體藥物研發(fā)技術(shù)、抗體衍生物研發(fā)技術(shù)（如雙功能抗體、納米抗體和抗體支架展示技術(shù)等）以及抗體進一步應(yīng)用技術(shù)（如嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)、嵌合抗原受體NK細(xì)胞技術(shù)和抗體藥物偶聯(lián)物等）等新藥創(chuàng)制不同階段的關(guān)鍵核心技術(shù)，結(jié)合我國新藥創(chuàng)制現(xiàn)狀，突破共性關(guān)鍵技術(shù)，開展高通量藥物篩選新技術(shù)、高通量測序技術(shù)、人源化動物模型構(gòu)建技術(shù)、人工智能藥物設(shè)計技術(shù)、智能藥物制備技術(shù)、質(zhì)控技術(shù)和佐劑研發(fā)技術(shù)等關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)，全面提升我國新藥創(chuàng)制的核心競爭力。

4.3 避免同質(zhì)化競爭，形成產(chǎn)品專利保護樹

目前我國藥物研發(fā)同質(zhì)化競爭嚴(yán)重，聚焦單一靶點往往有幾十種以上的在研藥物，導(dǎo)致“多、小、散”現(xiàn)象凸顯。因此，在立足自主創(chuàng)新、尋找差異化的同時，要高度重視知識產(chǎn)權(quán)工作，加大對原始創(chuàng)新的激勵保護，用知識產(chǎn)權(quán)鑄造發(fā)展利器。在抗體等藥物整個研究與開發(fā)的全過程，重視對研發(fā)技術(shù)、產(chǎn)品組方、活性成分、質(zhì)控方法、制劑及新的醫(yī)藥用途等方面實施全方位的專利保護和布局，形成產(chǎn)品專利保護樹，穩(wěn)固主要核心產(chǎn)品的市場地位。