幼齡1型糖尿病模型小鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞的鑒定及其成脂分化能力

張金霞，劉偉江，蘇菲婭，張 晗，于豐實(shí)，白海濤，袁福臨，劉元林，李 雪，王 洋，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，天津 300052；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是由胰島β細(xì)胞被免疫性破壞導(dǎo)致胰島素分泌不足引起的一種高血糖及糖代謝異常的免疫性疾病［1］。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)的最新研究報(bào)告指出，患有T1DM的兒童和青少年（0～19歲）已達(dá)110萬(wàn)，成為威脅世界各國(guó)兒童健康的新問(wèn)題［2］。目前，T1DM仍以注射外源性胰島素替代療法為主，并不能阻止和修復(fù)破壞的胰島細(xì)胞［3-4］，迫切需要研發(fā)新的治療方法。因此，修復(fù)和再生胰島細(xì)胞成為治療的關(guān)鍵。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類能夠自我更新并可分化為多種功能細(xì)胞的成體干細(xì)胞，可從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織和臍帶等［5-6］。MSC具有免疫調(diào)節(jié)特性和再生胰島素細(xì)胞的能力，對(duì)糖尿病患者展現(xiàn)出良好的治療潛力［7］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中，靜脈注射同種異體臍帶或骨髓來(lái)源的MSC，可有效改善胰腺β細(xì)胞的功能，有些患者可出現(xiàn)短期的血糖正常、脫離胰島素治療的現(xiàn)象［8-12］。由于脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSC）具有易獲取、來(lái)源豐富、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性和作用成為MSC臨床應(yīng)用的理想種子細(xì)胞［13-15］。T1DM患者糖代謝異常導(dǎo)致明顯的消瘦，體重減輕；自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗炎因子增多，體內(nèi)微環(huán)境改變。而ADSC作為脂肪組織微環(huán)境的主要細(xì)胞成分之一，在維持細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)控脂肪前體細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此推測(cè)，ADSC可能影響T1DM的發(fā)展及脂肪形成，但尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究制備幼齡T1DM小鼠模型，觀察其ADSC的成脂和成骨分化能力，為揭示T1DM患者消瘦的原因及闡明T1DM發(fā)病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只3周齡雄性 C57BL/6J小鼠，體重9.5～10.5 g，北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（京）2019-0010，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h晝夜交替，環(huán)境溫度22～25℃，相對(duì)濕度為35%～50%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和主要儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、油紅O、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、維生素C磷酸鹽、β-磷酸甘油和堿性磷酸酶，美國(guó)Sigma公司；Ⅱ型膠原酶、丙酮酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉和4%多聚甲醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；α-MEM、0.25%胰酶、PBS緩沖液、胎牛血清和Trizol試劑，美國(guó)Gibco公司；兔抗小鼠胰島素單抗，美國(guó)Abcam公司；流式抗體〔FITC標(biāo)記抗小鼠CD11b，Sca-1，CD34和CD45抗體；PE標(biāo)記抗小鼠CD90、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）、CD31和CD29抗體〕，美國(guó)ThermoFisher公司；RTase M-MLV、RNA酶抑制劑及5×RTase M-MLV緩沖液，日本TaKaRa公司；DTT、dNTP、無(wú)RNA酶水和2×Mltra Master Mix，中國(guó)康為世紀(jì)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）引物由上海生工生物有限公司合成（表1）。穩(wěn)擇易型血糖儀和穩(wěn)擇易型血糖試紙，美國(guó)強(qiáng)生公司；低溫冷凍離心機(jī)、Qubit?2.0熒光定量?jī)x和7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó) Thermo Fisher公司；流式細(xì)胞儀Facscalibur，美國(guó)BD公司；倒置相差顯微鏡和正置顯微鏡，日本Nikon公司。

Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 幼齡T1DM小鼠模型的制備和鑒定

取20只SPF級(jí)3周齡C57BL/6J雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。隨機(jī)分為T1DM模型組和正常對(duì)照組，每組10只。T1DM模型組連續(xù)5 d ip給予STZ 50 mg·kg-1，7 d后連續(xù)3 d尾靜脈取血，檢測(cè)空腹隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖均值≥16.7 mmol·L-1為建模成功。正常對(duì)照組ip給予等體積檸檬酸緩沖液。造模成功后14，21和28 d分別檢測(cè)空腹隨機(jī)血糖和體重變化，14 d后取胰腺組織進(jìn)行石蠟切片，固定后進(jìn)行HE染色顯微鏡下觀察胰腺組織的病理改變。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺組織胰島素水平，胰島素水平用陽(yáng)性染色積分吸光度值表示。

1.4 幼齡T1DM模型小鼠ADSC的分離和培養(yǎng)

建模成功14 d后，脫頸處死正常對(duì)照組和T1DM模型組小鼠，無(wú)菌條件下取腹股溝和性腺周圍的脂肪組織，膠原酶消化法制備ADSC，用α-MEM培養(yǎng)基37℃，5%CO2孵育。每2～3 d換液，直至細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)傳代。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞表面標(biāo)志物測(cè)定

將T1DM模型組和正常對(duì)照組小鼠ADSC原代培養(yǎng)至第2～5天，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；培養(yǎng)至第3代（P3代）時(shí)，倒置顯微鏡和Giemsa染色觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

選用P3代細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。所用流式抗體為FITC-抗小鼠CD11b、PE-抗小鼠 CD31、FITC-抗小鼠CD34、PE-抗小鼠CD29、FITC-抗小鼠CD45、PE-抗小鼠MHCⅡ、FITC-抗小鼠Sca-1和PE-抗小鼠CD90單抗，抗體稀釋比和操作步驟同抗體說(shuō)明書(shū)。

1.6 體外誘導(dǎo)成骨分化能力的測(cè)定

選來(lái)源于T1DM模型組和正常對(duì)照組小鼠P3代ADSC，胰酶消化、離心后，以每孔3×104細(xì)胞密度接種于6孔板，設(shè)自分化（未誘導(dǎo)）組和成骨誘導(dǎo)分化組。待細(xì)胞貼壁24 h后，成骨誘導(dǎo)分化組更換為成骨誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)分化體系為β-磷酸甘油10 mmol·L-1、地塞米松 0.1 μmol·L-1和維生素 C 磷酸鹽50 μmol·L-1，誘導(dǎo)7～14 d。誘導(dǎo)7 d后堿性磷酸酶染色，PBS清洗后丙酮固定，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌終止顯色反應(yīng)。藍(lán)紫色增加表明堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，ADSC成骨分化能力增強(qiáng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Ost和Runx2 mRNA表達(dá)。

1.7 體外誘導(dǎo)成脂分化能力的測(cè)定

選來(lái)源于T1DM模型組和正常對(duì)照組小鼠P3代ADSC，胰酶消化、離心后，接種于6孔板，自分化（未誘導(dǎo)）組和成脂誘導(dǎo)分化組分別以每孔2×104和1×105細(xì)胞密度接種于6孔板內(nèi)。24 h細(xì)胞貼壁后，成脂誘導(dǎo)分化組更換為成脂誘導(dǎo)液。成脂誘導(dǎo)分化體系為吲哚美辛0.5 mmol·L-1、胰島素10 μg·L-1、地塞米松1 μmol·L-1和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol·L-1。誘導(dǎo)9 d后，多聚甲醛固定，油紅O染色，顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量。RT-PCR檢測(cè)成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CEBPα和PPARγ mRNA表達(dá)。

對(duì)公共圖書(shū)館招聘信息中的其他需求進(jìn)行詞頻可視化的結(jié)果顯示，公共圖書(shū)館的其他招聘要求主要集中于考核方式和限制條件（見(jiàn)圖5）。由于公共圖書(shū)館的招聘面向群體更廣，自主權(quán)更大，因此一些省份對(duì)應(yīng)屆生和社會(huì)人員的招聘分開(kāi)進(jìn)行，沿海省份如廣東、上海、福建、遼寧、天津等地對(duì)于非應(yīng)屆生有戶籍限制。公共圖書(shū)館更青睞職稱較高的館員，對(duì)具有中級(jí)和副高級(jí)職稱的非應(yīng)屆生實(shí)行優(yōu)先錄取政策，說(shuō)明公共圖書(shū)館更加注重應(yīng)聘者的工作經(jīng)驗(yàn)。

1.8 RT-PCR檢測(cè)成骨和成脂分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)

Trizol法提取各組細(xì)胞的總mRNA，取1 μg定量逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，RT-PCR檢測(cè)CEBPα和PPARγ及Ost和Runx2 mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，PCR 上下游引物（10 μmol·L-1）1 μL，RT-PCR Master Mix 10 μL和無(wú)RNA酶水8 μL；反應(yīng)條件：95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 1 min）40個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△Ct表示待測(cè)基因mRNA表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 幼齡T1DM小鼠模型的鑒定

圖1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，T1DM模型組小鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多尿、多食等癥狀，外觀毛發(fā)暗淡無(wú)光澤，體型消瘦（圖1A），且體重增長(zhǎng)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05，圖1B）；血糖水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，圖1C），隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1。表明幼齡T1DM小鼠模型制備成功。

Fig.1 General physiological status（A），body mass（B）and blood glucose concentration（C）of streptozotocin（STZ）-induced young type 1 diabetes mellitus（T1DM）model mice.T1DM model was induced in three-week-old male C57BL/6 mice using STZ 50 mg·kg-1ip via tail vein for 5 d，and body mass and blood glucose were tested at 14，21 and 28 d，respectively.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 幼齡T1DM模型小鼠胰腺組織病理改變

HE染色結(jié)果（圖2A1）表明，正常對(duì)照組胰島組織結(jié)構(gòu)完整；T1DM模型組胰島組織結(jié)構(gòu)基本被破壞，依稀可見(jiàn)形態(tài)不規(guī)則的殘存結(jié)構(gòu)，胰島面積顯著小于正常對(duì)照組（P＜0.01）（圖2A2）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果（圖2B1）顯示，T1DM模型組胰島組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，胰島素免疫陽(yáng)性反應(yīng)較正常對(duì)照組降低，表明胰島素分泌明顯減少（P＜0.01）（圖2B2）。提示經(jīng)STZ誘導(dǎo)后小鼠胰腺組織發(fā)生糖尿病典型的病理改變，進(jìn)一步表明幼齡T1DM小鼠模型制備成功。

Fig.2 Pathological changes of pancreas in STZ-induced young T1DM model mice at 28 d.See Fig.1 for the mouse treatment.A1：HE staining，the arrows show islet tissue；A2：the area of islet cells，semi-quantitative results of A1；B1：immunohistochemical staining，the arrows show insulin secretion；B2：insulin content，semi-quantitative results of B1.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 幼齡T1DM模型小鼠ADSC的鑒定

2.3.1 ADSC細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志物

Fig.3 Morphology（A and B）and phenotype（C and D）of adipogenic stem cells（ADSCs）from young T1DM mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A1 and B1：ADSCs digested by collagenase and amplified to the passage 3 in vitro；A2 and B2：cell morphology after Giemsa staining.

2.3.2 ADSC體外誘導(dǎo)成骨和成脂分化能力

分離培養(yǎng)的幼齡T1DM模型和正常對(duì)照組小鼠ADSC，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)分化后，自分化（未誘導(dǎo)）組無(wú)堿性磷酸酶著色，而誘導(dǎo)組出現(xiàn)大量藍(lán)紫色（圖4A），提示ADSC堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，具有成骨分化能力；RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組ADSC Runx2和Ost mRNA表達(dá)較自分化組均顯著增加（P＜0.01）（圖4C）。采用油紅O染色檢測(cè)結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)組ADSC出現(xiàn)大量紅色花環(huán)樣脂滴，脂滴融合為串珠樣，充滿整個(gè)視野，而自分化組幾乎無(wú)脂滴（圖4B）；RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)較自分化組亦顯著增加（P＜0.01）（圖4D）。以上結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的ADSC具有多向分化能力。

Fig.4 In vitro differentiation ability of ADSCs derived from young T1DM model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：osteogenic differentiation examined by alkaline phosphatase staining；B：adipocyte formation examined by Oil Red O staining；C：the key transcription factor expression during osteogenic differentiation detected by RT-PCR；D：the key transcription factors expression during adipogenic differentiation detected by RT-PCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（self differentiation）group.

2.4 幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力增高

進(jìn)一步比較正常對(duì)照組幼齡小鼠和幼齡T1DM模型小鼠ADSC體外成脂分化能力。油紅O染色結(jié)果顯示，2組細(xì)胞經(jīng)體外成脂誘導(dǎo)分化5 d，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴形成（圖略）。誘導(dǎo)分化第9天正常幼齡小鼠和T1DM模型小鼠自分化組均無(wú)脂滴出現(xiàn)（圖5A，數(shù)據(jù)略），但正常幼齡小鼠和T1DM幼齡小鼠誘導(dǎo)組均可見(jiàn)較多紅色脂滴，且T1DM模型組紅色脂滴大且聚集融合（圖5A），脂滴數(shù)亦顯著多于正常誘導(dǎo)組（P＜0.01）（圖5B）。

Fig.5 Difference in adipogenic differentiation of ADSCs in vitro between normal young mice and young mice with T1DM detected by Oil Red O staining.See Fig.1 for the mouse treatment.A：adipogenic differentiation；B：number of lipid droplets after adipogenic differentiation.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

RT-PCR結(jié)果（圖6）表明，正常對(duì)照組幼齡小鼠和幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂誘導(dǎo)后，PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)從第6天起開(kāi)始升高（P＜0.01），直至誘導(dǎo)結(jié)束第12天，T1DM模型誘導(dǎo)組ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)均顯著高于正常誘導(dǎo)組（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，T1DM模型小鼠ADSC的成脂分化能力顯著高于正常幼齡小鼠ADSC。

Fig.6 Difference in key transcription factors PPAR γ（A）and CEBP α（B）mRNA expressions in vitro between normal young mice and young mice with T1DM during induction of adipogenic differentiation of ADSCs by RT-PCR.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding self differentiation group；##P＜0.01，compared with corresponding adipogenic differentiation group.

3 討論

ADSC是指存在于脂肪組織中具有自我更新和多向分化潛能的成體MSC。ADSC因其具有來(lái)源廣泛、體內(nèi)含量多、免疫原性低、分離提取時(shí)對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，使ADSC具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［13］。有研究表明，ADSC可提高糖尿病患者胰島素及C肽水平，有效降低糖化血紅蛋白水平［16-17］。但因T1DM個(gè)體長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境，且晚期糖基化終末物和活性氧及酮體等物質(zhì)增多，這些因素是否對(duì)自身ADSC數(shù)量以及增殖能力等生物學(xué)功能產(chǎn)生影響目前尚不清楚，

為此，本研究利用幼齡小鼠T1DM模型，探討T1DM小鼠ADSC生物學(xué)特性是否發(fā)生改變，為闡明T1DM發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過(guò)連續(xù)小劑量ip給予STZ成功構(gòu)建3周幼齡小鼠T1DM模型，成模后提取T1DM小鼠皮下脂肪和性腺周圍脂肪，分離培養(yǎng)ADSC。結(jié)果表明，幼齡T1DM小鼠ADSC的細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣、貼壁生長(zhǎng)，與正常幼齡小鼠ADSC相似。經(jīng)傳代后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表型，結(jié)果顯示均高表達(dá)CD29，CD90和Sca-1，不表達(dá)或低表達(dá) CD31，CD45，CD34，CD11b和MHC Ⅱ，提示培養(yǎng)的T1DM小鼠ADSC其細(xì)胞表型與正常幼齡小鼠ADSC亦無(wú)差異。進(jìn)一步對(duì)幼齡T1DM小鼠ADSC進(jìn)行成脂和成骨的誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明，其具有成脂和成骨的分化能力，油紅O染色和堿性磷酸酶染色均呈陽(yáng)性，且相關(guān)成脂和成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和CEBPα及Runx2和Ost mRNA表達(dá)均顯著增高。上述結(jié)果表明，幼齡T1DM模型小鼠即使出現(xiàn)明顯消瘦，但在其脂肪組織中仍存在一定數(shù)量ADSC，并且成脂分化能力增強(qiáng)可能補(bǔ)充了體內(nèi)消耗的脂肪，從而維持機(jī)體代謝平衡，這為研究T1DM患者脂代謝提供了理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力較正常對(duì)照組小鼠ADSC顯著增強(qiáng)，油紅O染色脂滴數(shù)量明顯增多，且細(xì)胞內(nèi)脂滴增大；T1DM模型組ADSC成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和CEBPα mRNA表達(dá)水平亦顯著高于正常對(duì)照組，提示T1DM模型小鼠ADSC更易分化為脂肪細(xì)胞。T1DM患者發(fā)病后多表現(xiàn)為體質(zhì)消瘦，胰島破壞，胰島素分泌不足，導(dǎo)致機(jī)體不能充分利用葡萄糖產(chǎn)生能量，使脂肪消耗增加，脂肪細(xì)胞體積減少。

目前針對(duì)T1DM患者ADSC成脂分化能力增強(qiáng)的作用機(jī)制尚不清楚。以往研究結(jié)果表明，體外高糖環(huán)境和晚期糖基化終末產(chǎn)物增多，引起氧化應(yīng)激及慢性炎癥，使ADSC成骨分化能力降低，成脂能力增強(qiáng)［18-19］。Pourgholaminejad等［20］報(bào)道，炎性因子可顯著提高ADSC的成脂分化能力。而T1DM作為一個(gè)慢性炎癥性疾病，是否由于患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致ADSC脂肪分化能力增強(qiáng)以維持體內(nèi)脂肪代謝平衡，尚需深入探討。